Detta protokoll beskriver den kvantitativa självlysande detektionen av proteinnedbrytningskinetik i levande celler som har konstruerats med CRISPR / Cas9 för att uttrycka antikroppsfri endogen proteindetekteringstagg smält till ett målprotein. Detaljerade instruktioner för beräkning och erhållande av kvantitativa nedbrytningsparametrar, hastighet, Dmax, DC 50 och Dmax50 ingår.
Riktade proteinnedbrytningsföreningar, inklusive molekylära lim eller proteolys riktade mot chimärer, är en spännande ny terapeutisk modalitet vid upptäckt av småmolekylära läkemedel. Denna klass av föreningar inducerar proteinnedbrytning genom att föra i närheten av målproteinet och E3-ligasmaskinproteinerna som krävs för att ubiquitinera och slutligen bryta ner målproteinet genom den ubiquitin-proteasomala vägen (UPP). Profilering av målproteinnedbrytning på ett sätt med hög genomströmning är dock fortfarande mycket utmanande med tanke på komplexiteten i cellulära vägar som krävs för att uppnå nedbrytning. Här presenterar vi ett protokoll och en screeningstrategi baserad på användningen av CRISPR/Cas9 endogen märkning av målproteiner med 11 aminosyran HiBiT-taggen som kompletterar med hög affinitet till LgBiT-proteinet, för att producera ett självlysande protein. Dessa CRISPR-riktade cellinjer med endogena taggar kan användas för att mäta sammansatt inducerad nedbrytning i antingen realtid, kinetisk levande cell eller slutpunktslytiska lägen genom att övervaka självlysande signal med hjälp av en självlysande plattbaserad läsare. Här beskriver vi de rekommenderade screeningprotokollen för de olika formaten och beskriver också beräkningen av viktiga nedbrytningsparametrar för hastighet, Dmax, DC 50, Dmax50, samt multiplexering med cellviabilitetsanalyser. Dessa tillvägagångssätt möjliggör snabb upptäckt och triagering av föreningar i tidigt stadium samtidigt som endogent uttryck och reglering av målproteiner i relevanta cellulära bakgrunder bibehålls, vilket möjliggör effektiv optimering av blyterapeutiska föreningar.
Riktad proteinnedbrytning har framstått som ett av de snabbast växande områdena inom upptäckt av småmolekylära läkemedel, vilket förstärks kraftigt av den terapeutiska framgången för immunmodulerande molekylära limföreningar (t.ex. IMiD) för cancerbehandling och lovande tidiga kliniska prövningsdata för proteolys riktad mot chimärföreningar 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Riktade proteinnedbrytningsföreningar fungerar genom att föra ett målprotein i närheten med E3-ligasmaskinproteiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Denna föreningsinducerade rekrytering av målproteinet till E3-ligasen leder till målproteinets ubiquitination och nedbrytning via ubiquitinproteasomal väg (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historiskt sett har screeningprogram för småmolekylära läkemedelsupptäckter förlitat sig på initiala biokemiska analyser för att bedöma aktivitet och rangordna orderföreningar. Detta har dock inneburit en betydande utmaning för riktade proteinnedbrytare vars slutliga aktivitet, nedbrytning via proteasomen, är beroende av en kaskad av cellulära händelser 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De många vägarna och komplexiteten hos proteinkomplex som krävs för den framgångsrika målnedbrytningen kräver cellulära analysmetoder för tidig screening och triaging av initiala föreningar. För närvarande saknas det allvarligt tillgång till teknik för att övervaka målproteinnedbrytning på ett sätt med hög genomströmning i samband med den celluläramiljön14. Här kommer vi att presentera protokoll för bedömning av kinetisk levande cell eller slutpunktslytisk nedbrytningsaktivitet i realtid med hjälp av CRISPR / Cas9 endogent taggade HiBiT-målcellinjer 18,19,20 för att övervaka förlusten av målproteinet via självlysande mätning efter behandling med nedbrytarföreningar10,11,18,19.
För att uppnå framgångsrik nedbrytning av terapeutiska mål och för att expandera det läkemedelsbara proteomet har många tillvägagångssätt och typer av nedbrytare uppstått som kan rikta in sig på ett brett spektrum av proteiner för destruktion, inklusive de som är lokaliserade vid eller i plasmamembranet, lysosomer, mitokondriella membran, cytoplasma och kärnan21–57. De två primära klasserna av föreningar som studeras mest är molekylära lim och proteininriktade cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Molekylära lim är monovalenta, alltså vanligtvis mindre i storlek, och underlättar ett nytt protein:proteininteraktionsgränssnitt med ett målprotein vid bindning till en E3-ligaskomponent 2,12,26. De är oftast nedbrytare som binder till Cereblon (CRBN) E3-ligaskomponenten 2,12,26,55,56,57. Nyligen har dock spännande nya exempel som använder andra E3-ligasmaskiner som DCAF1558,59,60 och CDK / Cyclin-rekrytering till DDB145 visar potentialen för expansion av denna klass av föreningar. Däremot är PROTACs större, bivalenta molekyler, bestående av en målbindande ligand, oftast en hämmare, bryggad via en kemisk länkare till ett E3-ligashandtag 1,3,4,5,7,13. Som sådan kan dessa föreningar direkt binda till både E3-ligasen och målproteinet 1,3,4,5,7,13. Många proteiner har visat sig brytas ned via dessa bivalenta molekyler, och de mest använda E3-ligashandtagen rekryterar antingen CRBN eller Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Antalet tillgängliga handtag för E3-ligasrekrytering i chimärer riktade mot proteolysdesign växer dock snabbt och utökar kapaciteten hos denna klass av föreningar med potential att bryta ner olika målklasser samt förbättra cell- eller vävnadstypspecificitet 24,48,61,62 . I kombination med det minimala kravet att engagera ett målprotein, även med marginell affinitet, håller nedbrytningsföreningar löfte om att expandera det läkemedelsbara proteomet.
Att karakterisera den cellulära dynamiken i proteinförlust, såväl som potentiell proteinåtervinning efter behandling, är avgörande för att förstå nedbrytningsföreningens funktion och effekt. Även om det är möjligt att studera endogena proteinnivåförändringar i relevanta cellulära system med western blot-antikroppsanalyser eller masspektrometri, är dessa metoder svåra att anpassa till screeningformat med hög genomströmning, har begränsad kvantifieringsförmåga eller förmåga att mäta kinetiska förändringar vid många tidpunkter14. För att ta itu med dessa utmaningar har vi utvecklat ett plattbaserat cellulärt självlysande system för övervakning av förändringar i endogena proteinnivåer, som använder genomisk insättning via CRISPR / Cas9 av 11-aminosyrataggen, HiBiT, till loci för alla viktiga nedbrytningsmål18,19,20. Denna peptid kompletterar med hög affinitet till sin bindande partner, LgBiT, för att producera ljus luminescens i närvaro av dess substrat 18,19,20,63, vilket gör dessa märkta endogena proteiner självlysande i celler eller lysater 18,19,20,63 . De relativa ljusenheterna (RLU) som mäts med ett luminometerinstrument är direkt proportionella mot de märkta målproteinnivåerna 18,19,20,63. Med utvecklingen av stabiliserade luciferassubstrat är kinetiska proteinnivåmätningar i realtid över 24-48 timmars tidsramar möjliga 18,53,64. Detta gör det möjligt att bestämma en fullständig nedbrytningsprofil för ett givet mål vid en given koncentration av föreningar, inklusive kvantitativ analys av initial nedbrytningshastighet, maximal nedbrytning (Dmax) och återvinning efter sammansatt behandling18,53. Vid screening av stora bibliotek av nedbrytningsföreningar kan slutpunktsanalys emellertid också lätt utföras i 384-brunnsformat vid olika läkemedelskoncentrationer och bestämda tidpunkter.
Protokollen som presenteras i detta manuskript representerar cellulära screeningstrategier för riktade proteinnedbrytningsföreningar, tillämpliga för alla typer av nedbrytare. Användningen av HiBiT CRISPR-cellinjer tillsammans med dessa protokoll är dock inte begränsade till proteinnedbrytning, snarare är de allmänna verktyg för att övervaka alla endogena målproteinnivåer som kan moduleras efter behandling för att studera effekterna av föreningar eller till och med resistensmekanismer 20,65,66. En förutsättning för dessa självlysande baserade detektionsmetoder är en CRISPR-endogent taggad HiBiT-målcellinje, vilket är kritiskt eftersom det möjliggör känslig självlysande detektion, samtidigt som det bibehåller endogent måluttryck och inbyggd promotorreglering18,19,20. Betydande framsteg har gjorts när det gäller att använda CRISRP/Cas9 för införande av genomiska taggar, särskilt i skalbarhet 20 och med den höga känsligheten för detektion, i olika format inklusive CRISPR-pooler eller kloner med antingen heterozygota eller homozygota alleliska infogningar18,19,20. Användning av exogent uttryck av HiBiT eller andra reporterfusioner i celler i stället för endogen märkning är möjlig, men betydande försiktighet bör iakttas med system med proteinöveruttryck14,18. Dessa kan leda till artefakter för att förstå sann sammansatt styrka och proteinåtervinningsdynamik14,18, inklusive potentiella transkriptionella återkopplingsslingor aktiverade efter målnedbrytning. Dessutom kan föreningar i tidigt skede med låg styrka missas och presentera sig som falska negativa vid screening. Eftersom proteinförlust kan bero på föreningsinducerad toxicitet och celldöd, innehåller protokollen som beskrivs här starkt rekommenderade, men valfria cellviabilitet självlysande eller fluorescerande analyser i kombination med nedbrytningsprotokollet. Det finns två huvudavsnitt i protokollet, lytisk slutpunkt och levande cellkinetisk screening. Inom vart och ett av dessa avsnitt ingår alternativ för multiplexerade cellviabilitetsmätningar i slutpunkts- eller kinetiska format. Övervakning av förändringarna av det taggade endogena proteinet kräver komplementering med LgBiT i celler. Därför hänvisar avsnittet om kinetisk screening till viktiga protokoll för införandet av detta, vilket kan uppnås via övergående eller stabilt uttryck och är viktigt för att utföra de levande cellens självlysande mätningar. Alla tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör snabb rangordning och aktivitetsbedömning av föreningar, vilket möjliggör tidiga screeninginsatser för föreningar och snabbare identifiering av blynedbrytare.
Detta protokoll är utformat för studier av nedbrytningsföreningar i samband med en HiBiT CRISPR-cellinje. Protokoll för generering av HiBiT CRISPR-infogningar för många mål har beskrivits i flera nyligen publiceradepublikationer 18,19,20.
Vi presenterar här två metoder för screening av nedbrytningsföreningsaktivitet i antingen slutpunktslytiskt format eller levande cellkinetiskt läge. Dessa tillvägagångssätt bygger på samma självlysande mätprinciper men ger ändå olika nivåer av detaljer och förståelse. Valet av endera metoden kommer sannolikt att bero på screeningmål och storleken på det sammansatta biblioteket. För stora sammansatta screeningdäck eller primära skärmar för att observera någon detekterbar nedbrytning, erbjuder slutpunktslytisk screening känslig och effektiv kompatibilitet med hög genomströmning där andra slutpunktsmetoder, såsom western blot eller masspektrometri, kan vara antingen opraktiska eller svåra att anpassa14. En utgångspunkt för dessa skärmar kan utföras med ett begränsat antal koncentrationer och tidpunkter. Rekommenderade initiala koncentrationer att testa ligger i intervallet 100 nM-10 μM, för att ta hänsyn till initiala nedbrytare med låg styrka, dålig permeabilitet eller i vissa fall med mycket potenta föreningar, närvaron av en krokeffekt. Det rekommenderas vidare att minst två olika tidpunkter testas för att fastställa tidig nedbrytning vid 4-6 timmar och latent eller ihållande nedbrytning vid 18-24 timmar. Föreningar som uppvisar hög nedbrytningsstyrka och on-target-mekanism observeras lätt inom en tidsram på 4-6 timmar, medan nedbrytning eller uppenbar proteinförlust som observeras endast vid senare tidpunkter kan bero på en mängd olika mekanismer. Det rekommenderas starkt att övervaka cellviabiliteten vid både tidiga och sena tidpunkter, så att proteinförlust kan frikopplas från förlust på grund av celldöd. I likhet med alla typer av självlysande eller fluorescerande analyser finns det en potential för föreningar i bibliotek att störa eller hämma signal, därför kommer ortogonala uppföljningsexperiment med blyföreningar med hjälp av orelaterade fusioner eller alternativa metoder för att övervaka proteinnivån att vara viktiga för att bedöma att förlust av RLU i dessa analyser är direkt associerad med målproteinnedbrytning.
Möjligheten att screena i levande cellkinetiskt format under längre tidsperioder är starkt beroende av analyssignalen till bakgrunden (S: B). Faktorer som bidrar till S: B inkluderar uttrycksnivån för själva målproteinet, som kan sträcka sig över flera storleksordningar, effektiviteten av LgBiT-uttrycket i cellinjen som valts för peptidinsättning, och tillgängligheten av det taggade målet för komplettering i dess olika inbyggda komplex. Vi har fastställt ett allmänt cutoff-krav bestående av en S:B på 15 för att framgångsrikt mäta nedbrytning i kinetiskt läge med antingen Endurazin eller Vivazine. S:B bestäms genom att mäta baslinjesignalen för de HiBiT-redigerade cellerna som samuttrycker LgBiT i förhållande till oredigerade föräldraceller som uttrycker LgBiT ensamt i närvaro av antingen Endurazin eller Vivazine levande cellsubstrat. Vivazin kommer att producera en högre självlysande signal men kommer att förfalla snabbare än Endurazine och kan begränsa signalinhämtningen till 24 timmar eller mindre. Dessutom kan S:B också vara mycket beroende av om CRISPR-pooler eller kloner används. För mål i cellinjer som är mer mottagliga och har hög effektivitet för CRISPR/Cas9-teknik kan en heterogen CRISPR-poolpopulation av redigerade celler ha tillräckligt med S:B för kinetisk analys. För mål i svårare cellinjer där mindre effektiv genomisk integration via CRISPR resulterar i pooler med lågt S:B kan det vara nödvändigt att isolera CRISPR-kloner för att berika redigerade populationer och uppnå ett tillräckligt högt S:B för kinetisk analys. För något av dessa scenarier, om S:B är mindre än 15 med antingen Endurazin- eller Vivazine-substrat, rekommenderas slutpunktslytisk screening.
För bättre förståelse och karakterisering av föreningar, inklusive bestämning av en nedbrytningsprofil med kvantitativa parametrar, är kinetisk analys i realtid i levande celler den rekommenderade screeningmetoden14,18. Liksom slutpunktsanalys som diskuterats ovan kan initial kinetisk screening göras med ett begränsat antal koncentrationer i intervallet 100nM-10μM på sätt med hög genomströmning. I 384-brunnsformat kan över 100 föreningar lätt screenas i tre exemplar i en koncentration på en enda platta. De resulterande nedbrytningsprofilerna kommer att ge vägledning inte bara om omfattningen av den nedbrytning som observerats, utan också nedbrytningshastigheten, nedbrytningens varaktighet och potentiell återvinning av proteinet14,18 (figur 2 och figur 3). Nedbrytningsprofilens former ger också värdefull information. Specifika och potenta nedbrytare visar ofta en initial snabb förlust av målproteinet till en platå på några timmar18,53, medan andra mekanismer såsom transkriptionell återkoppling eller sammansatt toxicitet vanligtvis resulterar i mer linjär förlust av proteinet över tid. Dessa detaljer och nyanser missas med slutpunktslytisk analys, och med realtidsanalys under 24-48 timmar behöver man inte förutsäga tiden för att fånga den sanna Dmax inom uppsättningar av nya eller okända föreningar.
Kinetik i realtid möjliggör också effektiv dosresponsscreening för att bättre förstå föreningseffektivitet, hur föreningskoncentrationen påverkar initial nedbrytningshastighet och erbjuder möjligheter att rangordna föreningar baserat på mer än en parameter. Klassiska mätningar av nedbrytningsstyrka involverar DC50-beräkningar vid en specifik tidpunkt baserat på skenbar nedbrytningsmaxima. Däremot innehåller vårt kinetiska tillvägagångssätt för att utvärdera styrkan det sanna nedbrytningsmaximumet vid varje koncentration oavsett när det inträffar i tid18. Vi kallar denna mätning av kinetisk nedbrytningsstyrka, Dmax5018. Analys på detta sätt står för föreningar som kan initiera nedbrytning långsammare vid lägre koncentrationer och därför ta längre tid efter behandlingen för att nå deras Dmax. Det kan vara särskilt informativt att rangordna föreningar på både nedbrytningshastighet och Dmax. För de mest potenta nedbrytarna kommer detta att ytterligare skilja långsamma, men potenta nedbrytare från de som är både snabba och potenta. Tillsammans är både lytisk och levande cellkinetisk screening med HiBiT CRISPR-cellinjer kraftfulla tillvägagångssätt som ger en mer omfattande bild av riktad proteinnedbrytning, föreningsfunktion och möjliggör screeningprocessen från initial aktivitetsbedömning till nedströms kemisk optimering genom förbättring av viktiga nedbrytningsparametrar.
The authors have nothing to disclose.
K.M.R, S.D.M, M.U. och D.L.D är alla anställda i Promega Corporation
CellTiter-Glo 2.0 reagent | Promega | G9241 | Cell Viability luminescent assay |
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay | Promega | G6080 | Cell Viability fluorescent assay |
CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045-088 | Cell culture |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | For compound dilution and control |
DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
Fetal Bovine Serum | Seradigm | 89510-194 | Cell culture |
HEK293 LgBiT stable cell line | Promega | N2672 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
HiBiT CRISPR mammalian cell line | Promega | https://www.promega.com/crispr-tpd | |
Hygromycin B solution | Gibco | 10-687-010 | Cell culture |
LgBiT BacMam | Promega | CS1956C01 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
LgBiT Expression Vector | Promega | N2681 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
Luminometer Plate Reader | Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000) | ||
NanoGlo Endurazine live cell substrate | Promega | N2570 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo Vivazine live cell substrate | Promega | N2580 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system | Promega | N3030 | Enpoint lytic HiBiT reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher) | ThermoFisher | 11058-021 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 96 well plate | Costar | 3917 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 384 well plate | Corning | 3570 | Cell culture |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25300 | Cell culture |