Denne protokol beskriver den kvantitative selvlysende detektion af proteinnedbrydningskinetik i levende celler, der er konstrueret ved hjælp af CRISPR / Cas9 til at udtrykke antistoffri endogen proteindetektionsmærke smeltet sammen med et målprotein. Detaljerede instruktioner til beregning og opnåelse af kvantitative nedbrydningsparametre, hastighed, Dmax, DC 50 og Dmax50 er inkluderet.
Målrettede proteinnedbrydningsforbindelser, herunder molekylær lim eller proteolyse rettet mod kimærer, er en spændende ny terapeutisk modalitet inden for opdagelse af lægemidler med små molekyler. Denne klasse af forbindelser inducerer proteinnedbrydning ved at bringe målproteinet og E3-ligasemaskineriproteinerne i nærheden, der kræves for at ubiquitinere og i sidste ende nedbryde målproteinet gennem ubiquitin-proteasomal vej (UPP). Profilering af målproteinnedbrydning på en måde, der er høj kapacitet, er imidlertid fortsat meget udfordrende i betragtning af kompleksiteten af cellulære veje, der kræves for at opnå nedbrydning. Her præsenterer vi en protokol og screeningsstrategi baseret på brugen af CRISPR/Cas9 endogen mærkning af målproteiner med 11 aminosyren HiBiT-tag, som supplerer med høj affinitet til LgBiT-proteinet, for at producere et selvlysende protein. Disse CRISPR-målrettede cellelinjer med endogene tags kan bruges til at måle sammensat induceret nedbrydning i enten realtids, kinetisk levende celle eller slutpunktslytiske tilstande ved at overvåge selvlysende signal ved hjælp af en selvlysende pladebaseret læser. Her skitserer vi de anbefalede screeningsprotokoller for de forskellige formater og beskriver også beregningen af nøglenedbrydningsparametre for hastighed, Dmax, DC 50, Dmax50 samt multiplexing med cellelevedygtighedsassays. Disse tilgange muliggør hurtig opdagelse og triaging af forbindelser i det tidlige stadium, samtidig med at endogen ekspression og regulering af målproteiner opretholdes i relevante cellulære baggrunde, hvilket muliggør effektiv optimering af blyterapeutiske forbindelser.
Målrettet proteinnedbrydning har vist sig at være et af de hurtigst voksende områder inden for opdagelse af småmolekyler, stærkt styrket af den terapeutiske succes med immunmodulerende molekylære limforbindelser (f.eks. IMiD) til kræftbehandling og lovende tidlige kliniske forsøgsdata for proteolyse Målretning af kimærforbindelser 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Målrettede proteinnedbrydningsforbindelser fungerer ved at bringe et målprotein i nærheden med E3 ligase maskinproteiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Denne sammensatte rekruttering af målproteinet til E3-ligasen fører til målproteinets ubiquitination og nedbrydning via ubiquitin proteasomal vej (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historisk set har screeningsprogrammer for små molekyler til opdagelse af lægemidler været afhængige af indledende biokemiske assays for at vurdere aktivitet og rangordensforbindelser. Dette har imidlertid givet en betydelig udfordring for målrettede proteinnedbrydere, hvis ultimative aktivitet, nedbrydning via proteasomet, er afhængig af en kaskade af cellulære hændelser 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De mange veje og kompleksiteten af proteinkomplekser, der kræves for den vellykkede målnedbrydning, nødvendiggør cellulære assaymetoder til tidlig screening og triaging af indledende forbindelser. I øjeblikket mangler tilgængeligheden af teknologier til overvågning af målproteinnedbrydning på en måde med høj kapacitet i forbindelse med det cellulære miljøalvorligt 14. Her vil vi præsentere protokoller for realtids kinetisk levende celle eller endepunkts lytisk nedbrydningsaktivitetsvurdering ved hjælp af CRISPR / Cas9 endogent mærket HiBiT-målcellelinjer 18,19,20 for at overvåge tabet af målproteinet via selvlysende måling efter behandling med nedbrydende forbindelser10,11,18,19.
For at opnå en vellykket nedbrydning af terapeutiske mål og for at udvide det lægemiddelbare proteom er der opstået adskillige tilgange og typer af nedbrydere, som kan målrette mod en bred vifte af proteiner til destruktion, herunder dem, der er lokaliseret ved eller i plasmamembranen, lysosomer, mitokondriemembraner, cytoplasma og kernen 21-57. De to primære klasser af forbindelser, der er mest grundigt undersøgt, er molekylære lim og protein rettet mod cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Molekylære lim er monovalente, således typisk mindre i størrelse, og letter en ny protein: protein interaktion grænseflade med et målprotein ved binding til en E3 ligase komponent 2,12,26. De er oftest nedbrydere, der binder til Cereblon (CRBN) E3 ligase komponent 2,12,26,55,56,57. For nylig viser spændende nye eksempler, der bruger andre E3 ligasemaskiner, såsom DCAF1558,59,60 og CDK/cyclin rekruttering til DDB145, potentialet for udvidelse af denne klasse af forbindelser. I modsætning hertil er PROTAC’er større, bivalente molekyler, der består af en målbindende ligand, oftest en hæmmer, der via en kemisk linker er forbundet til et E3-ligasehåndtag 1,3,4,5,7,13. Som sådan er disse forbindelser i stand til direkte binding til både E3-ligasen og målproteinet 1,3,4,5,7,13. Talrige proteiner har vist sig at være nedbrudt via disse bivalente molekyler, og de mest anvendte E3 ligase håndtag rekrutterer enten CRBN eller Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Antallet af tilgængelige håndtag til E3 ligaserekruttering i kimærer rettet mod proteolysedesign vokser imidlertid hurtigt, hvilket udvider kapaciteten i denne klasse af forbindelser med potentiale til at nedbryde forskellige målklasser samt forbedre celle- eller vævstypespecificitet 24,48,61,62 . Kombineret med det minimale krav om at engagere et målprotein, selv med marginal affinitet, har nedbrydningsforbindelser løfte om at udvide det lægemiddelbare proteom.
Karakterisering af den cellulære dynamik i proteintab såvel som potentiel proteingendannelse efter behandling er afgørende for at forstå nedbrydningsforbindelsens funktion og effektivitet. Selvom det er muligt at studere endogene ændringer i proteinniveauet i relevante cellulære systemer med western blot-antistofassays eller massespektrometri, er disse tilgange vanskelige at tilpasse til screeningsformater med høj kapacitet, har begrænset kvantificeringskapacitet eller evne til at måle kinetiske ændringer på mange tidspunkter14. For at løse disse udfordringer har vi udviklet et pladebaseret cellulært selvlysende system til overvågning af ændringer i endogene proteinniveauer, som anvender genomisk indsættelse via CRISPR / Cas9 af 11 aminosyremærket, HiBiT, til stedet for ethvert centralt nedbrydningsmål18,19,20. Dette peptid supplerer med høj affinitet til sin bindingspartner, LgBiT, for at producere lys luminescens i nærværelse af dets substrat 18,19,20,63, hvorved disse mærkede endogene proteiner lyser i celler eller lysater18,19,20,63 . De relative lysenheder (RLU’er) målt med et luminometerinstrument er direkte proportionale med de mærkede målproteinniveauer 18,19,20,63. Med udviklingen af stabiliserede luciferasesubstrater er kinetiske proteinniveaumålinger i realtid over 24-48 timers tidsrammer mulige 18,53,64. Dette gør det muligt at bestemme en fuldstændig nedbrydningsprofil for et givet mål ved en given sammensat koncentration, herunder kvantitativ analyse af initial nedbrydningshastighed, nedbrydningsmaksimum (Dmax) og genopretning efter sammensat behandling18,53. Hvis man screener store biblioteker af nedbrydningsforbindelser, kan slutpunktsanalyse imidlertid også let udføres i 384-brøndformat ved forskellige lægemiddelkoncentrationer og udpegede tidspunkter.
De protokoller, der præsenteres i dette manuskript, repræsenterer cellulære screeningsstrategier for målrettede proteinnedbrydningsforbindelser, der gælder for alle typer nedbrydere. Brugen af HiBiT CRISPR-cellelinjer sammen med disse protokoller er imidlertid ikke begrænset til proteinnedbrydning, snarere er de generelle værktøjer til overvågning af ethvert endogent målproteinniveau, som kan moduleres efter behandling for at studere virkningen af forbindelser eller endda resistensmekanismer 20,65,66. En forudsætning for disse selvlysende baserede detektionsmetoder er en CRISPR-endogent mærket HiBiT-målcellelinje, hvilket er kritisk, da det muliggør følsom selvlysende detektion, samtidig med at der opretholdes endogen målekspression og indfødt promotorregulering18,19,20. Der er gjort betydelige fremskridt med at anvende CRISRP/Cas9 til indsættelse af genomiske tags, især i skalerbarhed 20 og med høj detektionsfølsomhed, i forskellige formater, herunder CRISPR-puljer eller kloner med enten heterozygote eller homozygote alleliske indsættelser18,19,20. Det er muligt at anvende eksogen ekspression af HiBiT eller andre reporterfusioner i celler i stedet for endogen mærkning, men der bør udvises betydelig forsigtighed ved hjælp af systemer med proteinoverekspression14,18. Disse kan føre til artefakter i forståelsen af ægte sammensat styrke og proteingendannelsesdynamik14,18, herunder potentielle transkriptionelle feedback-sløjfer aktiveret efter målnedbrydning. Derudover kan forbindelser i tidlig fase med lav styrke gå glip af og præsentere sig som falske negativer i screening. Da proteintab kan skyldes sammensat induceret toksicitet og celledød, indeholder de her beskrevne protokoller stærkt anbefalede, men valgfri cellelevedygtighed selvlysende eller fluorescerende assays parret med nedbrydningsprotokollen. Der er to hovedafsnit til protokollen, lytisk endepunkt og levende cellekinetisk screening. Inden for hver af disse sektioner er der inkluderet indstillinger for multipleksede cellelevedygtighedsmålinger i slutpunkts- eller kinetiske formater. Overvågning af ændringerne af det mærkede endogene protein kræver komplementering med LgBiT i celler. Derfor henviser afsnittet om kinetisk screening til vigtige protokoller for introduktionen af dette, som kan opnås via forbigående eller stabil ekspression og er afgørende for at udføre de levende celle selvlysende målinger. Alle tilgange, der præsenteres her, muliggør hurtig rangordinering og aktivitetsvurdering af forbindelser, hvilket muliggør tidlig fase sammensat screeningsindsats og hurtigere identifikation af blynedbrydere.
Denne protokol er designet til undersøgelse af nedbrydningsforbindelser i forbindelse med en HiBiT CRISPR-cellelinje. Protokoller til generering af HiBiT CRISPR-indsættelser til adskillige mål er blevet skitseret i flere nylige publikationer18,19,20.
Vi præsenterer her to metoder til screening af nedbrydningsforbindelsesaktivitet i enten endepunktslytisk format eller levende cellekinetisk tilstand. Disse tilgange er baseret på de samme selvlysende måleprincipper, men giver alligevel forskellige detaljeringsniveauer og forståelse. Valget af en af tilgangene vil sandsynligvis afhænge af screeningsmål og størrelsen af det sammensatte bibliotek. For store sammensatte screeningsdæk eller primære skærme til at observere enhver påviselig nedbrydning tilbyder endpoint lytisk screening følsom og effektiv kompatibilitet med høj kapacitet, hvor andre endepunktstilgange, såsom western blot eller massespektrometri, kan være enten upraktiske eller vanskelige at tilpasse14. Et udgangspunkt for disse skærme kunne udføres med et begrænset antal koncentrationer og tidspunkter. Anbefalede indledende koncentrationer til test ligger i området 100 nM-10 μM for at tage højde for indledende nedbrydere med lav styrke, dårlig permeabilitet eller i nogle tilfælde med meget potente forbindelser, tilstedeværelsen af en krogeffekt. Det anbefales endvidere, at mindst to forskellige tidspunkter testes for at fastslå tidlig nedbrydning ved 4-6 timer og latent eller vedvarende nedbrydning ved 18-24 timer. Forbindelser, der udviser høj nedbrydningsstyrke og on-target-mekanisme, observeres let inden for en tidsramme på 4-6 timer, mens nedbrydning eller tilsyneladende proteintab, der kun observeres på senere tidspunkter, kan skyldes en række mekanismer. Det anbefales stærkt at overvåge cellens levedygtighed på både tidlige og sene tidspunkter, således at proteintab kan afkobles fra tab på grund af celledød. I lighed med enhver form for selvlysende eller fluorescerende assay er der et potentiale for forbindelser i biblioteker til at forstyrre eller hæmme signal, derfor vil ortogonale opfølgningseksperimenter med blyforbindelser ved hjælp af ikke-relaterede fusioner eller alternative tilgange til overvågning af proteinniveau være vigtige for at vurdere, at tab af RLU i disse assays er direkte forbundet med målproteinnedbrydning.
Evnen til at screene i levende cellekinetisk format over længere perioder afhænger i høj grad af analysesignalet til baggrunden (S: B). Faktorer, der bidrager til S: B, inkluderer ekspressionsniveauet for selve målproteinet, som kan spænde over flere størrelsesordener, effektiviteten af LgBiT-ekspression i cellelinjen valgt til peptidindsættelse, og tilgængeligheden af det mærkede mål til komplementering i dets forskellige indfødte komplekser. Vi har etableret et generelt afskæringskrav bestående af en S: B på 15 for med succes at måle nedbrydning i kinetisk tilstand med enten Endurazine eller Vivazin. S:B bestemmes ved at måle basissignalet for de HiBiT-redigerede celler, der co-udtrykker LgBiT i forhold til uredigerede forældreceller, der udtrykker LgBiT alene i nærværelse af enten Endurazin eller Vivazine levende cellesubstrater. Vivazin vil producere et højere selvlysende signal, men vil henfalde hurtigere end Endurazin og kan begrænse signaloptagelse til 24 timer eller mindre. Desuden kan S:B også være meget afhængig af, om der anvendes CRISPR-puljer eller kloner. For mål i cellelinjer, der er mere modtagelige og har høj effektivitet til CRISPR / Cas9-teknik, kan en heterogen CRISPR-poolpopulation af redigerede celler have tilstrækkelig S: B til kinetisk analyse. For mål i vanskeligere cellelinjer, hvor mindre effektiv genomisk integration via CRISPR resulterer i puljer med lav S: B, kan det være nødvendigt at isolere CRISPR-kloner for at berige redigerede populationer og opnå en tilstrækkelig høj S: B til kinetisk analyse. For ethvert af disse scenarier, hvis S: B er mindre end 15 med enten Endurazin- eller Vivazin-substrater, anbefales endepunktslytisk screening.
For bedre forståelse og karakterisering af forbindelser, herunder bestemmelse af en nedbrydningsprofil med kvantitative parametre, er kinetisk analyse i realtid i levende celler den anbefalede screeningsmetode14,18. Ligesom endepunktsanalyse diskuteret ovenfor kan indledende kinetisk screening udføres med et begrænset antal koncentrationer i området 100nM-10μM på høj kapacitet. I 384-brøndformat kan over 100 forbindelser let screenes i tre eksemplarer i en koncentration på en enkelt plade. De resulterende nedbrydningsprofiler vil ikke kun give vejledning om omfanget af den observerede nedbrydning, men også nedbrydningshastigheden, nedbrydningens varighed og potentiel genvinding af proteinet14,18 (figur 2 og figur 3). Nedbrydningsprofilens former giver også værdifuld information. Specifikke og potente nedbrydere viser ofte et indledende hurtigt tab af målproteinet til et plateau i løbet af få timer18,53, mens andre mekanismer såsom transkriptionel feedback eller sammensat toksicitet typisk resulterer i mere lineært tab af proteinet over tid. Disse detaljer og nuancer savnes med slutpunktslytisk analyse, og med realtidsanalyse over 24-48 timer behøver man ikke at forudsige tiden for at fange den sande Dmax inden for sæt af nye eller ukendte forbindelser.
Kinetik i realtid giver også mulighed for effektiv dosisresponsscreening for bedre at forstå forbindelseseffektivitet, hvordan sammensat koncentration påvirker den indledende nedbrydningshastighed og giver muligheder for at rangere forbindelser baseret på mere end en parameter. Klassiske målinger af nedbrydningsstyrke involverer DC50-beregninger på et bestemt tidspunkt baseret på tilsyneladende nedbrydningsmaksima. I modsætning hertil inkorporerer vores kinetiske tilgang til evaluering af styrke det sande nedbrydningsmaksimum ved hver koncentration, uanset hvornår det sker i tid18. Vi kalder denne måling af kinetisk nedbrydningsstyrke, Dmax5018. Analyse på denne måde tegner sig for forbindelser, der kan initiere nedbrydning langsommere ved lavere koncentrationer og derfor tager længere tid efter behandling for at nå deres Dmax. Det kan være særligt informativt at rangere forbindelser på både nedbrydningshastighed og Dmax. For de mest potente nedbrydere vil dette yderligere differentiere langsomme, men potente nedbrydere fra dem, der er både hurtige og potente. Sammen er både lytisk og levende cellekinetisk screening ved hjælp af HiBiT CRISPR-cellelinjer kraftfulde tilgange, der giver et mere omfattende billede af målrettet proteinnedbrydning, sammensat funktion og muliggør screeningsprocessen fra indledende aktivitetsvurdering til nedstrøms kemisk optimering gennem forbedring af nøglenedbrydningsparametre.
The authors have nothing to disclose.
K.M.R, S.D.M, M.U. og D.L.D er alle ansatte i Promega Corporation
CellTiter-Glo 2.0 reagent | Promega | G9241 | Cell Viability luminescent assay |
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay | Promega | G6080 | Cell Viability fluorescent assay |
CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045-088 | Cell culture |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | For compound dilution and control |
DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
Fetal Bovine Serum | Seradigm | 89510-194 | Cell culture |
HEK293 LgBiT stable cell line | Promega | N2672 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
HiBiT CRISPR mammalian cell line | Promega | https://www.promega.com/crispr-tpd | |
Hygromycin B solution | Gibco | 10-687-010 | Cell culture |
LgBiT BacMam | Promega | CS1956C01 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
LgBiT Expression Vector | Promega | N2681 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
Luminometer Plate Reader | Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000) | ||
NanoGlo Endurazine live cell substrate | Promega | N2570 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo Vivazine live cell substrate | Promega | N2580 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system | Promega | N3030 | Enpoint lytic HiBiT reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher) | ThermoFisher | 11058-021 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 96 well plate | Costar | 3917 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 384 well plate | Corning | 3570 | Cell culture |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25300 | Cell culture |