Um pequeno RNA não codificante MicC contribui para a virulência em proteínas da membrana externa em Salmonella enteritidis
Summary
Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.
Abstract
Um pequeno RNA não codificante (sRNA) é um novo fator para regular a expressão gênica em nível pós-transcricional. Uma espécie de sRNA MicC, conhecido em Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, poderia reprimir a expressão de proteínas da membrana externa. Para investigar melhor a função de regulação do micC em Salmonella Enteritidis, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis e, em seguida, construímos o mutante 50336Δ micC pelo sistema de recombinação baseado em λ Red e o mutante complementado 50336Δ micC/p micC carregando plasmídeo recombinante pBR322 expressando micC. Os resultados da qRT-PCR demonstraram que a transcrição de ompD em 50336Δ micC foi 1,3 vezes maior do que na cepa selvagem, enquanto a transcrição de ompA e ompC em 50336ΔmicC foi 2,2 vezes maior e 3 vezes maior do que na cepa selvagem. Estes indicaram que micC reprime a expressão de ompA e ompC. No estudo seguinte, a patogenicidade de 50336ΔmicC foi detectada por camundongos Balb/c de 6 semanas de idade e galinhas de 1 dia de idade. O resultado mostrou que a DL 50 da linhagem selvagem 50336, os mutantes 50336Δ micC e 50336Δ micC/p micC para camundongos Balb/c com 6 semanas de idade foram 12,59 UFC, 5,01 UFC e 19,95 UFC, respectivamente. As DL 50 das cepas para frangos de 1 dia de idade foram 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC e2,54 x 10 8 UFC, respectivamente. Isso indicou que a deleção de micC aumentou a virulência de S. Enteritidis em camundongos e galinhas regulando a expressão de proteínas da membrana externa.
Introduction
Os pequenos RNAs não codificantes (sRNAs) têm 40-400 nucleotídeos de comprimento, que geralmente não codificam proteínas, mas podem ser transcritos independentemente em cromossomos bacterianos 1,2,3. A maioria dos sRNAs é codificada nas regiões intergênicas (IGRs) entre regiões codificadoras de genes e interage com mRNAs alvo por meio de ações de pareamento de bases e regula a expressão de genes-alvo em nível pós-transcricional 4,5. Desempenham importantes papéis de regulação no metabolismo de substâncias, síntese de proteínas de membrana externa, quorum sensing e expressão gênica de virulência5.
MicC é um transcrito de RNA pequeno de 109 nucleotídeos presente em Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar Typhimurium, que poderia regular a expressão de múltiplas proteínas de membrana externa, como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. O MicC regula a expressão de OmpC inibindo a ligação do ribossomo ao líder de mRNA ompC in vitro e requer a chaperona de RNA Hfq para sua função em Escherichia coli6. Em Salmonella Typhimurium, MicC silencia o mRNA ompD através de um duplex de RNA de ≤12 pb dentro da sequência codificadora (códons 23-26) e, em seguida, desestabiliza o mRNA endonucleolítico7. Este processo de regulação é assistido pela proteína chaperona Hfq10. A OmpC é uma proteína abundante da membrana externa que foi considerada importante em ambientes onde as concentrações de nutrientes e toxinas eram elevadas, como no intestino6. A porina OmpD é a proteína de membrana externa mais abundante em Salmonella Typhimurium e representa cerca de 1% da proteína celular total11. A OmpD está envolvida na aderência a macrófagos humanos e células epiteliais intestinais12. MicC também reprime a expressão de porinas OmpC e OmpD. Acredita-se que MicC pode regular a virulência. Para explorar novos genes-alvo regulados por MicC e estudar a função de regulação de virulência do micC, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE) e, em seguida, construímos o mutante 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/p micC. Novos genes-alvo foram rastreados por qRT-PCR. A virulência de 50336ΔmicC foi detectada por infecções em camundongos e galinhas.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. A enteritidis é um importante patógeno intracelular facultativo que pode infectar galinhas jovens e produzir sintomas desde enterite até infecção sistêmica e morte17,18. Além disso, S. Enteritidis causa infecções latentes em frangos adultos e portadores crônicos contaminam produtos avícolas, resultando em infecções transmitidas por alimentos em humanos19. O mecanismo patogênico de S. Enteritidis …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da China (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Um Projeto Financiado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
Referências
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