En ikke-kodende lille RNA-mikrofon bidrager til virulens i ydre membranproteiner i Salmonella enteritidis

Summary

Et λ-rødmedieret rekombinationssystem blev brugt til at skabe en deletionsmutant af en lille ikke-kodende RNA-micC.

Abstract

Et ikke-kodende lille RNA (sRNA) er en ny faktor til regulering af genekspression på posttranskriptionelt niveau. En slags sRNA MicC, kendt i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke ekspressionen af ydre membranproteiner. For yderligere at undersøge reguleringsfunktionen af micC i Salmonella Enteritidis klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336Δ micC af λ Red-baseret rekombinationssystem og den komplementerede mutant 50336Δ micC/p micC, der bærer rekombinant plasmid pBR322, der udtrykker micC. qRT-PCR-resultater viste, at transkription af ompD i 50336Δ micC var 1,3 gange højere end i vildtypestammen, mens transkriptionen af ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 gange højere end dem i vildtypestammen. Disse indikerede, at micC undertrykker ekspressionen af ompA og ompC. I den følgende undersøgelse blev patogeniciteten af 50336ΔmicC påvist af både inficerende 6 uger gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste, at LD 50 af vildtypestammen 50336, mutanterne 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uger gamle Balb/c mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD₅₀ af stammerne til 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 10⁹ CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 10⁸ CFU. Det indikerede, at sletning af micC øgede virulensen af S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved at regulere ekspression af ydre membranproteiner.

Introduction

Ikke-kodende små RNA’er (sRNA’er) er 40-400 nukleotider lange, som generelt ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uafhængigt i bakteriekromosomer ^1,2,3. De fleste sRNA’er er kodet i de intergene regioner (IGR’er) mellem genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA’er gennem baseparringshandlinger og regulerer målgenekspression på posttranskriptionsniveau ^4,5. De spiller vigtige reguleringsroller i stofmetabolisme, proteinsyntese i ydre membran, quorum sensing og virulens genekspression⁵.

MicC er et 109-nukleotid lille RNA-transkript til stede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kunne regulere flere ydre membranproteinekspressioner såsom OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer ekspressionen af OmpC ved at hæmme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det kræver Hfq RNA-chaperon for dets funktion i Escherichia coli⁶. I Salmonella Typhimurium tavsgør MicC ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex inden for kodningssekvensen (kodoner 23-26) og destabiliserer derefter endonukleolytisk mRNA⁷. Denne reguleringsproces assisteres af chaperonprotein Hfq¹⁰. OmpC er et rigeligt ydre membranprotein, der blev anset for at være vigtigt i miljøer, hvor næringsstof- og toksinkoncentrationer var høje, såsom i tarmen⁶. OmpD porin er det mest rigelige ydre membranprotein i Salmonella Typhimurium og repræsenterer ca. 1% af det samlede celleprotein¹¹. OmpD er involveret i overholdelse af humane makrofager og intestinale epitelceller¹². MicC undertrykker også udtrykket af både OmpC og OmpD poriner. Det menes, at MicC kan regulere virulens. For at udforske nye målgener reguleret af MicC og studere virulensreguleringsfunktionen af micC, klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener blev screenet af qRT-PCR. Virulensen af 50336ΔmicC blev påvist af mus og kyllingeinfektioner.

Protocol

Alle forsøgene blev udført i overensstemmelse med Det Nationale Forskningsråds vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr. Dyrepleje- og brugsudvalget ved Yangzhou University godkendte alle forsøg og procedurer, der blev anvendt på dyrene (SYXK2016-0020). 1. Bakteriestammer, plasmider og kulturbetingelser Brug de bakterier og plasmider, der er anført i tabel 1. Kulturbakterier i LB-bouillon eller på LB-agarplader ved 37 °C under tilstedeværelse af…

Representative Results

Konstruktion af den mutante 50336Δ micC og suppleret stamme 50336Δ micC /pmicC MicC-genklonresultatet indikerede, at dette gen var sammensat af 109 bp, der viste 100% identitet med S. Typhimurium. Baseret på sekvensdataene blev deletionsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC/pmicC konstrueret med succes….

Discussion

S. Enteritidis er et vigtigt fakultativt intracellulært patogen, der kan inficere unge kyllinger og producerer symptomer fra enteritis til systemisk infektion og død^17,18. Derudover forårsager S. Enteritidis latente infektioner hos voksne kyllinger, og kroniske bærere forurener fjerkræprodukter, hvilket resulterer i fødevarebårne infektioner hos mennesker¹⁹. Den patogene mekanisme af S. Enteritidis skal undersøges…

Materials

dextrose	Sangon Biotech	A610219	for broth preparation
DNA purification kit	TIANGEN	DP214	for DNA purification
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608	for broth preparation
K2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent	20032116	for broth preparation
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP106	plasmid extraction
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	for broth preparation
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser	TaKaRa	RR047	qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qRT-PCR
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	Ligation
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA isolation
Tryptone	Oxoid	LP0042	for broth preparation
Yeast extract	Oxoid	LP0021	for broth preparation
centrifuge	Eppendorf	5418	centrifugation
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad	164-5050	Electrophoresis
Electroporation System	Bio-Rad	165-2100	for bacterial transformation
Spectrophotometer	BioTek	Epoch	Absorbance detection
Real-Time PCR system	Applied Biosystems	7500 system	qRT-PCR