RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס
Summary
מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.
Abstract
רנ”א קטן שאינו מקודד (sRNA) הוא גורם חדש המווסת ביטוי גנים ברמה שלאחר השעתוק. סוג של sRNA MicC, הידוע ב- Escherichia coli ו– Salmonella Typhimurium, יכול לדכא את הביטוי של חלבוני הממברנה החיצונית. כדי להמשיך לחקור את פונקציית הבקרה של micC בסלמונלה אנטריטידיס, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336Δ micC על ידי מערכת הרקומבינציה λ Red והמוטנט המשלים 50336Δ micC/p micC הנושא פלסמיד רקומביננטי pBR322 המבטא micC. תוצאות qRT-PCR הראו כי התמלול של ompD ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 1.3 מזה שבזן מסוג פראי, בעוד שהתעתוק של ompA ו- ompC ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 2.2 ופי 3 מאלה בזן מסוג פראי. אלה הצביעו על כך ש-micC מדחיק את הביטוי של ompA ו-ompC. במחקר הבא, הפתוגני של 50336ΔmicC זוהה הן על ידי הדבקת עכברים בני 6 שבועות Balb/c והן על ידי תרנגולות בנות יום אחד. התוצאות הראו כי LD 50 של זן פראי מסוג 50336, המוטנטים 50336Δ micC ו-50336Δ micC/pmicC עבור עכברי Balb/c בני 6 שבועות היו 12.59 CFU, 5.01 CFU, ו-19.95 CFU, בהתאמה. LD50 של זנים עבור תרנגולות בנות יום אחד היו 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, ו 2.54 x 108 CFU, בהתאמה. הוא הצביע על כך שמחיקת micC הגבירה את האלימות של S. Enteritidis בעכברים ותרנגולות על ידי ויסות ביטוי של חלבונים הממברנה החיצונית.
Introduction
RNA קטן שאינו מקודד (sRNAs) הוא באורך 40-400 נוקלאוטידים, אשר בדרך כלל אינם מקודדים חלבונים אך יכולים להיות משועתקים באופן עצמאי בכרומוזומי חיידקים 1,2,3. רוב ה-sRNAs מקודדים באזורים הבין-גניים (IGRs) בין אזורי קידוד גנים ומקיימים אינטראקציה עם mRNA מטרה באמצעות פעולות זיווג בסיסים, ומווסתים את ביטוי גני המטרה ברמהשלאחר השעתוק 4,5. הם ממלאים תפקידי ויסות חשובים במטבוליזם של חומרים, סינתזת חלבון בקרום החיצוני, חישת מניין וביטוי גנים אלימים5.
MicC הוא תעתיק RNA קטן של 109 נוקלאוטידים הקיים ב- Escherichia coli ו- Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר יכול לווסת ביטוי חלבון ממברנה חיצוני מרובים כגון OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ו- Omp36 6,7,8,9. MicC מווסת את הביטוי של OmpC על ידי עיכוב קשירת ריבוזום למוביל mRNA ompC במבחנה והוא דורש מלווה RNA Hfq עבור תפקודו ב- Escherichia coli6. בסלמונלה טיפימוריום, MicC משתיק mRNA ompD באמצעות דופלקס RNA של ≤12 bp בתוך רצף הקידוד (קודונים 23-26) ולאחר מכן מערער את היציבות של mRNA אנדונוקלאוליטי7. תהליך ויסות זה נעזר בחלבון מלווה Hfq10. ה-OmpC הוא חלבון מצוי בשפע בקרום החיצוני שנחשב חשוב בסביבות שבהן ריכוזי החומרים המזינים והרעלנים היו גבוהים, כמו במעי6. פורין OmpD הוא חלבון הממברנה החיצונית הנפוץ ביותר בסלמונלה טיפימוריום ומייצג כ -1% מכלל חלבון התא11. OmpD מעורב בהיצמדות למקרופאגים אנושיים ולתאי אפיתל מעיים12. MicC גם מדחיק את הביטוי של נקבוביות OmpC ו- OmpD. הוא חשב כי MicC עשוי לווסת אלימות. כדי לחקור גני מטרה חדשים המווסתים על ידי MicC ולחקור את פונקציית ויסות האלימות של micC, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis (SE) 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336ΔmicC ואת המוטציה המשלימה 50336ΔmicC/p micC. גני מטרה חדשים נבדקו על ידי qRT-PCR. האלימות של 50336ΔmicC זוהתה על ידי עכברים וזיהומי תרנגולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ס. Enteritidis הוא פתוגן תוך-תאי חשוב שיכול להדביק תרנגולות צעירות ומייצר תסמינים מדלקת מעיים ועד זיהום מערכתי ומוות17,18. בנוסף, S. Enteritidis גורם לזיהומים סמויים בתרנגולות בוגרות ונשאים כרוניים מזהמים מוצרי עופות, וכתוצאה מכך זיהומים המועברים במזון בבני אדם<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית הסינית למדע (מס ‘31972651 ו -31101826), קרן המדע להשכלה גבוהה ג’יאנגסו (No.14KJB230002), מעבדת מפתח המדינה לביוטכנולוגיה וטרינרית (No.SKLVBF201509), מענק קרן מדעי הטבע של יאנגז’ו (No.YZ2014019), פרויקט הממומן על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג’יאנגסו (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
