En icke-kodande liten RNA MicC bidrar till virulens i yttre membranproteiner i Salmonella enteritidis
Summary
Ett λ-rödmedierat rekombinationssystem användes för att skapa en deletionsmutant av en liten icke-kodande RNA micC.
Abstract
Ett icke-kodande litet RNA (sRNA) är en ny faktor för att reglera genuttryck på posttranskriptionsnivå. Ett slags sRNA MicC, känt i Escherichia coli och Salmonella Typhimurium, kan undertrycka uttrycket av yttre membranproteiner. För att ytterligare undersöka regleringsfunktionen hos micC i Salmonella Enteritidis klonade vi micC-genen i Salmonella Enteritidis-stammen 50336 och konstruerade sedan mutanten 50336Δ micC med λ Red-baserat rekombinationssystem och den kompletterade mutanten 50336Δ micC / p micC som bär rekombinant plasmid pBR322 som uttrycker micC. qRT-PCR-resultat visade att transkriptionen av ompD i 50336Δ micC var 1,3 gånger högre än i vildtypsstammen, medan transkriptionen av ompA och ompC i 50336Δ micC var 2,2 gånger och 3 gånger högre än i vildtypsstammen. Dessa indikerade att micC undertrycker uttrycket av ompA och ompC. I följande studie upptäcktes patogeniciteten hos 50336ΔmicC genom att både infektera 6 veckor gamla Balb/c-möss och 1 dag gamla kycklingar. Resultatet visade att LD 50 av vildtypsstammen 50336, mutanterna 50336Δ micC och 50336Δ micC/pmicC för 6 veckor gamla Balb/c-möss var 12,59 CFU, 5,01 CFU respektive 19,95 CFU. LD50 av stammarna för 1 dag gamla kycklingar var 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU respektive 2,54 x 108 CFU. Det indikerade att deletion av micC förbättrade virulensen hos S. Enteritidis hos möss och kycklingar genom att reglera uttrycket av yttre membranproteiner.
Introduction
Icke-kodande små RNA (sRNA) är 40-400 nukleotider långa, som i allmänhet inte kodar för proteiner men kan transkriberas oberoende i bakteriekromosomer 1,2,3. De flesta sRNA kodas i de intergena regionerna (IGR) mellan genkodande regioner och interagerar med mål-mRNA genom basparningsåtgärder och reglerar målgenuttryck på posttranskriptionsnivå 4,5. De spelar viktiga regleringsroller i substansmetabolism, yttre membranproteinsyntes, kvorumavkänning och virulensgenuttryck5.
MicC är ett 109-nukleotid-litet RNA-transkript närvarande i Escherichia coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kan reglera multipelt yttre membranproteinuttryck såsom OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 och Omp36 6,7,8,9. MicC reglerar uttrycket av OmpC genom att hämma ribosombindning till ompC mRNA-ledaren in vitro och det kräver Hfq RNA-chaperon för sin funktion i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium tystar MicC ompD-mRNA via en ≤12-bp RNA-duplex inom den kodande sekvensen (kodon 23-26) och destabiliserar sedan endonukleolytiskt mRNA7. Denna regleringsprocess stöds av chaperonprotein Hfq10. OmpC är ett rikligt yttre membranprotein som ansågs vara viktigt i miljöer där närings- och toxinkoncentrationerna var höga, till exempel i tarmen6. OmpD-porin är det vanligaste yttre membranproteinet i Salmonella Typhimurium och representerar cirka 1% av det totala cellproteinet11. OmpD är involverat i vidhäftning till humana makrofager och tarmepitelceller12. MicC undertrycker också uttrycket av både OmpC- och OmpD-poriner. Man tror att MicC kan reglera virulens. För att utforska nya målgener som regleras av MicC och studera virulensreglerande funktion hos micC, klonade vi micC-genen i Salmonella Enteritidis (SE) stam 50336 och konstruerade sedan mutanten 50336ΔmicC och den kompletterade mutanten 50336ΔmicC/p micC. Nya målgener screenades med qRT-PCR. Virulensen av 50336ΔmicC detekterades av möss och kycklinginfektioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. Enteritidis är en viktig fakultativ intracellulär patogen som kan infektera unga kycklingar och ger symtom från enterit till systemisk infektion och död17,18. Dessutom orsakar S. Enteritidis latenta infektioner hos vuxna kycklingar och kroniska bärare förorenar fjäderfäprodukter, vilket resulterar i livsmedelsburna infektioner hos människor19. Den patogena mekanismen för S. enteritidis återstår att undersö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från Chinese National Science Foundation (nr 31972651 och 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), ett projekt finansierat av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
