En ikke-kodende liten RNA-micC bidrar til virulens i ytre membranproteiner i Salmonella enteritidis

Summary

Et λ-Red-mediert rekombinasjonssystem ble brukt til å lage en delesjonsmutant av en liten ikke-kodende RNA-micC.

Abstract

Et ikke-kodende lite RNA (sRNA) er en ny faktor for å regulere genuttrykk på posttranskripsjonsnivå. En slags sRNA MicC, kjent i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke uttrykket av ytre membranproteiner. For ytterligere å undersøke reguleringsfunksjonen av micC i Salmonella Enteritidis, klonet vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336, og konstruerte deretter mutanten 50336Δ micC ved λ Red-basert rekombinasjonssystem og det komplementerte muterte 50336Δ micCmicC som bærer rekombinant plasmid pBR322 som uttrykker micC. qRT-PCR-resultater viste at transkripsjon av ompD i 50336Δ micC var 1,3 ganger høyere enn i villtypestammen, mens transkripsjonen av ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 ganger og 3 ganger høyere enn de i villtypestammen. Disse indikerte at micC undertrykker uttrykket av ompA og ompC. I den følgende studien ble patogeniteten til 50336ΔmicC påvist av både infiserende 6 uker gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste at LD 50 av villtypestammen 50336, mutantene 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uker gamle Balb/c-mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD₅₀ av stammene for 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 10⁹ CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 10⁸ CFU. Det indikerte at sletting av micC økte virulensen til S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved å regulere ekspresjon av ytre membranproteiner.

Introduction

Ikke-kodende små RNA (sRNA) er 40-400 nukleotider i lengde, som vanligvis ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uavhengig i bakterielle kromosomer ^1,2,3. De fleste sRNA er kodet i de intergeniske regionene (IGRs) mellom genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA gjennom baseparingshandlinger, og regulerer målgenuttrykk på posttranskripsjonsnivå ^4,5. De spiller viktige reguleringsroller i stoffmetabolisme, ytre membranproteinsyntese, quorumsensing og virulensgenuttrykk⁵.

MicC er et 109-nukleotid lite RNA-transkript tilstede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kan regulere flere ytre membranproteinuttrykk som OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer uttrykket av OmpC ved å hemme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det krever Hfq RNA-chaperone for sin funksjon i Escherichia coli⁶. I Salmonella Typhimurium slår MicC av ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex i kodingssekvensen (kodon 23-26) og destabiliserer deretter endonukleolytisk mRNA⁷. Denne reguleringsprosessen er assistert av chaperone protein Hfq¹⁰. OmpC er et rikelig ytre membranprotein som ble antatt å være viktig i miljøer der nærings- og toksinkonsentrasjoner var høye, for eksempel i tarmen⁶. OmpD-porin er det mest tallrike ytre membranproteinet i Salmonella Typhimurium og representerer ca. 1% av totalt celleprotein¹¹. OmpD er involvert i adherens til humane makrofager og tarmepitelceller¹². MicC undertrykker også uttrykket til både OmpC- og OmpD-poriner. Det antas at MicC kan regulere virulens. For å utforske nye målgener regulert av MicC og studere virulensreguleringsfunksjonen til micC, klonet vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336, og konstruerte deretter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerte mutanten 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener ble screenet med qRT-PCR. Virulensen av 50336ΔmicC ble påvist av mus og kyllinginfeksjoner.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med Veiledning for omsorg og bruk av forsøksdyr fra Det nasjonale forskningsrådet. Dyrepleie- og brukskomiteen ved Yangzhou University godkjente alle eksperimenter og prosedyrer som ble brukt på dyrene (SYXK2016-0020). 1. Bakteriestammer, plasmider og kulturforhold Bruk bakteriene og plasmidene listet opp i tabell 1. Dyrkningsbakterier i LB-buljong eller på LB-agarplater ved 37 °C, i nærvær av 50 μg/ml ampicilli…

Representative Results

Konstruksjon av mutanten 50336Δ micC og komplementert stamme 50336Δ micC / p micC micC-genklonresultatet indikerte at dette genet var sammensatt av 109 bp som viste 100% identitet med S. Typhimurium. Basert på sekvensdataene ble delesjonsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerte mutanten 50336ΔmicC/pmicC konstruert vellykke…

Discussion

S. Enteritidis er et viktig fakultativt intracellulært patogen som kan infisere unge kyllinger og produserer symptomer fra enteritt til systemisk infeksjon og død^17,18. I tillegg forårsaker S. Enteritidis latente infeksjoner hos voksne kyllinger og kroniske bærere forurenser fjærfeprodukter, noe som resulterer i matbårne infeksjoner hos mennesker¹⁹. Den patogene mekanismen til S. Enteritidis gjenstår å bl…

Materials

dextrose	Sangon Biotech	A610219	for broth preparation
DNA purification kit	TIANGEN	DP214	for DNA purification
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608	for broth preparation
K2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent	20032116	for broth preparation
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP106	plasmid extraction
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	for broth preparation
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser	TaKaRa	RR047	qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qRT-PCR
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	Ligation
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA isolation
Tryptone	Oxoid	LP0042	for broth preparation
Yeast extract	Oxoid	LP0021	for broth preparation
centrifuge	Eppendorf	5418	centrifugation
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad	164-5050	Electrophoresis
Electroporation System	Bio-Rad	165-2100	for bacterial transformation
Spectrophotometer	BioTek	Epoch	Absorbance detection
Real-Time PCR system	Applied Biosystems	7500 system	qRT-PCR