פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום לחץ גזירה באמצעות מודל שייקר מסלולית.
Abstract
לחץ גזירה שנכפה על דופן העורקים על ידי זרימת הדם משפיע על מורפולוגיה ותפקוד של תאי אנדותל. לחצים בדרגה נמוכה, נדנוד ורב-כיווני הונחו כולם כדי לעורר פנוטיפ פרו-אתרוסקלרוטי בתאי אנדותל, בעוד שגודל גבוה וגזירה חד-כיוונית או חד-ערוצית נחשבים לקידום הומאוסטזיס אנדותל. השערות אלה דורשות חקירה נוספת, אך טכניקות במבחנה מסורתיות יש מגבלות, והם עניים במיוחד בהטלת לחצים גזירה רב כיוונית על תאים.
שיטה אחת שצוברת שימוש גובר היא לתרבות תאי אנדותל בלוחות רב-באר סטנדרטיים על הפלטפורמה של שייקר מסלולי; בשיטה פשוטה, זולה, בעלת תפוקה גבוהה וכרונית זו, המדיום המסתחרר מייצר דפוסים ועוצמות שונות של גזירה, כולל גזירה רב-כיוונית, בחלקים שונים של הבאר. עם זאת, יש לו מגבלה משמעותית: תאים באזור אחד, החשופים לסוג אחד של זרימה, עשויים לשחרר מתווכים למדיום המשפיעים על תאים בחלקים אחרים של הבאר, חשופים לזרימות שונות, ומכאן מעוותים את הקשר לכאורה בין זרימה לפנוטיפ.
כאן אנו מציגים שינוי קל ובמחיר סביר של השיטה המאפשרת לתאים להיחשף רק למאפייני מתח גזירה ספציפיים. זריעת תאים מוגבלת לאזור מוגדר של הבאר על ידי ציפוי אזור העניין עם פיברונקטין, ואחריו פסיבציה באמצעות פתרון passivating. לאחר מכן, הצלחות ניתן להסתחרר על שייקר, וכתוצאה מכך חשיפה של תאים פרופילי גזירה מוגדרים היטב כגון גזירה רב כיוונית בעוצמה נמוכה או גזירה חד-כיוונית בעוצמה גבוהה, בהתאם למיקומם. כמו קודם, השימוש בכלי פלסטיק סטנדרטיים לתרבות התאים מאפשר ניתוח נוסף ופשוט של התאים. השינוי כבר איפשר הדגמה של מתווכים מסיסים, ששוחררו מאנדותל תחת מאפייני לחץ גזירה מוגדרים, המשפיעים על תאים הממוקמים במקומות אחרים בבאר.
Introduction
התגובות של תאי כלי הדם לסביבה המכנית שלהם חשובים בתפקוד תקין של כלי הדם ובהתפתחות של מחלה1. Mechanobiology של תאי אנדותל (ECs) כי קו פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם כבר מוקד מסוים של מחקר mechanobiological כי ECs לחוות ישירות את הלחץ גזירה שנוצר על ידי זרימת הדם מעליהם. שינויים פנוטיפיים שונים כגון תגובות דלקתיות, נוקשות ומורפולוגיה שהשתנו, שחרור חומרים vasoactive, לוקליזציה וביטוי של חלבונים junctional תלויים בחשיפה EC ללחץ גזירה2,3,4. תכונות אנדותל תלויות גזירה עשויות להסביר גם את ההתפתחות הלא יציבה של מחלות כגון טרשת עורקים5,6,7.
כדאי לחקור את ההשפעה של גזירה על מחשבים אלקטרוניים בתרבות, שם ניתן לשלוט בלחצים, וניתן לבודד ECs מסוגי תאים אחרים. התקני במבחנה הנפוצים להחלת לחץ גזירה על מחשבים אלקטרוניים כוללים את תא הזרימה של הלוח המקביל ואת viscometer חרוט וצלחת, אבל רק חד-מיני יציב, נדנוד, זרימה pulsatile ניתן להחיל8,9. למרות שפותחו תאי זרימה מותאמים עם גיאומטריות מחודדות או מסתעפות ושבבים מיקרופלואידיים המחקים גיאומטריה סטנוטית, התפוקה הנמוכה שלהם ומשך התרבות הקצר יחסית האפשרי מציבים אתגר10, 11.
שיטת שייקר מסלולית (או מערבולת היטב) לחקר mechanotransduction אנדותל, שבו תאים גדלים בכלי פלסטיק סטנדרטיים של תרבות התא להציב על הפלטפורמה של שייקר מסלולית, הוא צובר תשומת לב גוברת כי הוא מסוגל כרונית הטלת מורכבים, דפוסי מתח גזירה שונים מרחבית על ECs עם תפוקה גבוהה (ראה סקירה על ידי Warboys ואח’12). סימולציות דינמיקת נוזלים חישובית (CFD) הופעלו כדי לאפיין את הווריאציה המרחבית והטמפורלית של לחץ גזירה בבאר מתערבלת. התנועה המסתובבת של מדיום התרבות הנגרמת על ידי התנועה המסלולית של פלטפורמת השייקר שעליה ממוקמת הלוח מובילה לזרימה רב-כיוונית בדרגה נמוכה (LMMF, או זרימה פרו-אתרוגנית) במרכז וזרימה יוניקסיאלית בעוצמה גבוהה (HMUF, או זרימה את’רופקטיבית באופן פוטטיבי) בקצה הבארות של צלחת של 6 בארות. לדוגמה, לחץ גזירה קיר ממוצע זמן (TAWSS) הוא כ 0.3 Pa במרכז ו 0.7 Pa בקצה צלחת 6-באר הסתחרר ב 150 סל”ד עם רדיוס מסלולי 5 מ”מ13. השיטה דורשת רק כלי פלסטיק זמינים מסחרית ואת שייקר מסלולית עצמה.
יש, עם זאת, חיסרון לשיטה (ולשיטות אחרות של הטלת זרימות במבחנה): ECs לשחרר מתווכים מסיסים ומיקרו-חלקיקים באופן תלוי גזירה14,15,16 ו secretome זה עשוי להשפיע על ECs באזורים של הבאר מלבד זה שבו הם שוחררו, בשל ערבוב במדיום מתערבל. זה עשוי להסוות את ההשפעות בפועל של לחץ גזירה על פנוטיפ EC. לדוגמה, Ghim et al. העריכו כי זה מסביר את ההשפעה הזהה לכאורה של פרופילי גזירה שונים על הובלה טרנסצ’לית של חלקיקים גדולים17.
כאן אנו מתארים שיטה לקידום הידבקות תא אנדותל וריד טבור אנושי (HUVEC) באזורים ספציפיים של צלחת 6-באר באמצעות ציפוי פיברונקטין תוך שימוש F-127 פלורוני כדי להעביר את פני השטח ולמנוע צמיחה במקום אחר. השיטה פותרת את המגבלה שתוארה לעיל מכיוון, על ידי פילוח צמיחת תאים, מחשבים אלקטרוניים חווים רק סוג אחד של פרופיל גזירה, ואינם מושפעים מפרחומים ממחשבים אלקטרוניים החשופים לפרופילים אחרים במקומות אחרים בבאר.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת ה-swirling-well מסוגלת ליצור פרופילי זרימה מורכבים בבאר אחת – זרימה רב-כיוונית בעוצמה נמוכה (LMMF) במרכז וזרימה חד-ערוצית בעוצמה גבוהה (HMUF) בקצה הבאר. עם זאת, הפרשות גזירה בתיווך מתח של מתווך מסיס יהיה מעורב במדיום מתערבל להשפיע על התאים בבאר כולה, פוטנציאל מיסוך ההשפעה האמיתית של פרופיל מתח גזי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים בהכרת תודה על מענק פרויקט קרן הלב הבריטית (ל-PDW), המועצה הלאומית למחקר רפואי סינגפור TAAP ודינמו גרנט (ל-XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), מלגת בוגרי A*STAR (ל-KTP) ומרכז קרן הלב הבריטית למצוינות במחקר (לתואר שני).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
Referências
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
