메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장
Summary
본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 전단 응력 응용을 위한 6웰 플레이트의 특정 영역으로 내피 세포 성장을 제한하는 코팅 방법을 설명한다.
Abstract
혈액의 흐름에 의해 동맥 벽에 부과 된 전단 스트레스는 내피 세포 형태와 기능에 영향을 미칩니다. 낮은 크기, 진동 및 다방향 전단 응력은 모두 내피 세포에서 프로 죽상 경화성 표현형을 자극하기 위해 가정되어 왔지만, 반면 높은 크기와 단방향 또는 단방향 또는 단방향 전단은 내피 집집성을 촉진하는 것으로 생각된다. 이러한 가설은 추가 조사를 필요로하지만, 전통적인 체외 기술은 한계가 있으며, 세포에 다방향 전단 응력을 부과하는 특히 가난합니다.
점점 더 많은 사용을 얻고 있는 한 가지 방법은 궤도 셰이커의 플랫폼에 표준 다중 우물 판에서 내피 세포를 배양하는 것입니다. 이 간단하고 저렴한 고처리량 및 만성 방법에서 소용돌이 치는 매체는 다방향 전단을 포함한 다양한 패턴과 전단의 크기를 우물의 다른 부분에서 생성합니다. 그러나, 한 영역의 세포는 한 가지 유형의 흐름에 노출되어, 다른 흐름에 노출된 웰의 다른 부분에서 세포에 영향을 미치는 배지로 중재자를 방출할 수 있으므로 흐름과 표현형 사이의 명백한 관계를 왜곡할 수 있다.
여기서 우리는 세포가 특정 전단 응력 특성에만 노출 될 수있는 방법의 쉽고 저렴한 수정을 제시한다. 세포 파종은 섬유넥틴으로 관심 영역을 코팅한 다음 통과 용액을 사용하여 통과함으로써 우물의 정의된 영역으로 제한됩니다. 이어서, 플레이트는 셰이커에 소용돌이칠 수 있으며, 그 결과 위치에 따라 저크기 다방향 전단 또는 높은 크기의 단방향 전단과 같은 잘 정의된 전단 프로파일에 세포가 노출될 수 있다. 이전과 마찬가지로 표준 세포 배양 플라스틱웨어를 사용하면 세포에 대한 간단한 추가 분석이 가능합니다. 수정은 이미 잘의 다른 곳에 있는 세포에 영향을 미치는 정의된 전단 응력 특성의 밑에 내피성에서 풀어 놓인 수용성 중재자의 데모를 허용했습니다.
Introduction
그들의 기계적 환경에 혈관 세포의 반응은 혈관의 정상적인 기능과 질병1의발달에서 중요하다. 모든 혈관의 내부 표면을 일렬로 세이는 내피 세포(EC)의 기계생물학은 EC가 혈류에 의해 생성되는 전단 스트레스를 직접 경험하기 때문에 메카노생물학적 연구의 특정 초점이었습니다. 염증 반응, 변형된 강성 및 형태학, 혈관 활성 물질의 방출 및 접합 단백질의 국소화 및 발현과 같은 다양한 표현성 변화는 전단 응력2,3,4에EC 노출에 의존한다. 전단 의존성 내피 특성은 죽상 동맥 경화증5,6,7과같은 질병의 패치 개발을 설명할 수도 있다.
응력을 제어할 수 있는 문화권에서 전단이 IC에 미치는 영향을 연구하는 것이 유용하며, 다른 세포 유형으로부터 EC를 분리할 수 있습니다. 일반적으로 전단 응력적용을 위해 시험관내 장치에 사용되는 경우 병렬 플레이트 흐름 챔버와 원뿔 및 플레이트 바이코커만 포함하지만, 단원성 안정성, 진동 및 맥동유만8,9를적용할 수 있다. 스테노틱 기하학을 모방하는 테이퍼 또는 분기 형상 및 미세 유체 칩이 있는 수정된 유동 챔버가 개발되었지만, 낮은 처리량과 상대적으로 짧은 배양 기간은도전 10, 11을제기한다.
궤도 셰이커의 플랫폼에 배치된 표준 세포 배양 플라스틱웨어에서 세포가 재배되는 내피 메카노트랜스덕션 연구를 위한 궤도 셰이커(또는 소용돌이 잘 잘 돌리는) 방법은 만성적으로 복잡하고 공간적으로 다양한 전단 응력 패턴을 높은 처리량으로 EC에 부과할 수 있기 때문에 주목받고 있다(또는 소용돌이 잘 잘 돌리는) 방법(Warboys etalal12참조). 전산 유체 역학(CFD) 시뮬레이션은 소용돌이치는 우물에서 전단 응력의 공간 적 및 측두적인 변화를 특성화하기 위해 사용되었습니다. 플레이트가 배치되는 셰이커 플랫폼의 궤도 이동에 의해 야기되는 배양 배지의 소용돌이 운동은 6웰 플레이트의 우물 가장자리에 있는 중앙 및 고진도 동축 흐름(HMUF, 또는 putheroprotectionprotection flow)의 저진도 다방향 흐름(LMMF 또는 putativeandpro-atherogenic flow)으로 이어집니다. 예를 들어, 시간 평균 벽 전단 응력(TAWSS)은 중앙에 약 0.3Pa, 5mm 궤도 반경13로150rpm에서 소용돌이치는 6웰 플레이트 가장자리에서 0.7 Pa이다. 이 방법은 시판되는 플라스틱 제품과 궤도 셰이커 자체만 필요합니다.
그러나, 방법(및 시험관내에서 흐름을 부과하는 다른 방법에 대한 단점)에 대한 단점이 있다: EC는 전단 의존성 방식으로 용해성 중재자 및 미세입자를방출14,15,16 및 이 분비물은 소용돌이 치는 매체의 혼합으로 인해 방출된 것 이외의 우물의 영역에서 EC에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 EC 표현형에 전단 응력의 실제 효력을 마스크할 수 있습니다. 예를 들어, Ghim 외는 이것이 큰 입자의 세포간 수송에 대한 다른 전단 프로파일의 명백히 동일한 영향을 차지한다고추측했다(17).
여기서 우리는 플루론 F-127을 사용하여 표면을 통과시키고 다른 곳에서 성장을 방지하는 동안 섬유네틴 코팅을 사용하여 6웰 플레이트의 특정 영역에서 인간 배빌루칼 정맥 내피 세포(HUVEC) 접착을 촉진하는 방법을 설명한다. 이 방법은 셀 성장을 분할함으로써 EC가 한 종류의 전단 프로파일만 경험하고 우물의 다른 다른 프로파일에 노출된 다른 프로파일에 노출된 EC의 분비에 의해 영향을 받지 않기 때문에 위에서 설명한 한계를 해결합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
소용돌이 잘 하는 방법은 단일 우물에서 복잡한 흐름 프로파일을 생성할 수 있습니다- 중앙에 낮은 크기 다방향 흐름 (LMMF) 및 웰의 가장자리에 높은 크기 동방 흐름 (HMUF). 그러나, 용해 성 중재자의 전단 응력 매개 분비물은 소용돌이 배지에서 혼합되고 전체적으로 세포에 영향을 미치며, 잠재적으로 세포에 특정 전단 응력 프로파일의 진정한 효과를 마스킹한다.
여기서 입증?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사하게 영국 심장 재단 프로젝트 보조금을 인정 (PDW), 국립 의학 연구 위원회 싱가포르 TAAP 및 DYNAMO 보조금 (XW, NMRC / OFLCG/ 004/2018, NMRC / OFLCG / 0017), A * 스타 대학원 장학금 (KTP에), 및 연구 우수 의 영국 심장 재단 센터 (MAP에).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
Referências
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