Segmentation de la croissance des cellules endothéliales dans des plaques à 6 puits sur un agitateur orbital pour les études mécanobiologiques

Summary

Ce protocole décrit une méthode de revêtement pour limiter la croissance des cellules endothéliales à une région spécifique d’une plaque de 6 puits pour l’application de contrainte de cisaillement à l’aide du modèle de shaker orbital.

Abstract

L’effort de cisaillement imposé sur la paroi artérielle par le flux de sang affecte la morphologie et la fonction endothéliales de cellules. De basse ampleur, les contraintes oscillatoires et multidirectionnelles de cisaillement tous ont été postulés pour stimuler un phénotype pro-athérosclérotique en cellules endothéliales, tandis que l’ampleur élevée et le cisaillement unidirectionnel ou uniaxial sont pensés pour favoriser l’homéostasie endothéliale. Ces hypothèses exigent l’enquête plus approfondie, mais les techniques in vitro traditionnelles ont des limites, et sont particulièrement pauvres à imposer des contraintes de cisaillement multidirectionnel sur des cellules.

Une méthode qui gagne de plus en plus d’utilisation est de culturer des cellules endothéliales dans des plaques multi-puits standard sur la plate-forme d’un agitateur orbital; dans cette méthode simple, peu coûteuse, à haut débit et chronique, le milieu tourbillonnant produit différents modèles et amplitudes de cisaillement, y compris un cisaillement multidirectionnel, dans différentes parties du puits. Cependant, il a une limite importante: les cellules d’une région, exposées à un type d’écoulement, peuvent libérer des médiateurs dans le milieu qui affectent les cellules dans d’autres parties du puits, exposées à des écoulements différents, faussant ainsi la relation apparente entre l’écoulement et le phénotype.

Nous présentons ici une modification facile et abordable de la méthode qui permet aux cellules d’être exposées uniquement à des caractéristiques de contrainte de cisaillement spécifiques. L’ensemencement cellulaire est limité à une région définie du puits en recouvrant la région d’intérêt de fibronectine, suivie d’une passivation à l’aide d’une solution passivante. Par la suite, les plaques peuvent être tourbillonnées sur le shaker, ce qui entraîne l’exposition des cellules à des profils de cisaillement bien définis tels que le cisaillement multidirectionnel de faible magnitude ou le cisaillement uniaxial de magnitude élevée, selon leur emplacement. Comme précédemment, l’utilisation de plastiques de culture cellulaire standard permet une analyse plus approfondie des cellules. La modification a déjà permis la démonstration de médiateurs solubles, libérés par l’endothélium sous des caractéristiques de contrainte de cisaillement définies, qui affectent les cellules situées ailleurs dans le puits.

Introduction

Les réponses des cellules vasculaires à leur environnement mécanique sont importantes dans le fonctionnement normal des vaisseaux sanguins et dans le développement de la maladie¹. La mécanobiologie des cellules endothéliales (CE) qui tapent la surface intérieure de tous les vaisseaux sanguins a été un centre particulier de la recherche mécanobiologique parce que les CE subissent directement le stress de cisaillement généré par le flux sanguin sur eux. Divers changements phénotypiques tels que les réponses inflammatoires, la rigidité et la morphologie altérées, la libération de substances vasoactives, ainsi que la localisation et l’expression des protéines jonctionnelles dépendent de l’exposition à la CE au stress de cisaillement^2,3,4. Les propriétés endothéliales dépendantes du cisaillement peuvent également expliquer le développement inégal de maladies telles que l’athérosclérose^5,6,7.

Il est utile d’étudier l’effet du cisaillement sur les CE en culture, où les contraintes peuvent être contrôlées et où les CE peuvent être isolés d’autres types de cellules. Les dispositifs in vitro couramment utilisés pour appliquer une contrainte de cisaillement aux CE comprennent la chambre d’écoulement à plaques parallèles et le viscosimètre à cône et plaque, mais seuls les écoulements uniaxiaux stables, oscillatoires et pulsatiles peuvent être appliqués^8,9. Bien que des chambres d’écoulement modifiées avec des géométries coniques ou ramifiées et des puces microfluidiques imitant une géométrie par sténose aient été développées, leur faible débit et la durée de culture relativement courte qui est possible posent un défi^{10, 11.}

La méthode du shaker orbital (ou du tourbillon bien) pour l’étude de la mécanotransduction endothéliale, dans laquelle les cellules sont cultivées dans un plastique de culture cellulaire standard placé sur la plate-forme d’un shaker orbital, attire de plus en plus l’attention parce qu’elle est capable d’imposer de manière chronique des modèles de contrainte de cisaillement complexes et spatialement variables sur les CE à haut débit (voir l’examen par Warboys et al.^12). Des simulations de dynamique des fluides numérique (CFD) ont été utilisées pour caractériser la variation spatiale et temporelle de la contrainte de cisaillement dans un puits tourbillonnant. Le mouvement tourbillonnant du milieu de culture causé par le mouvement orbital de la plate-forme agitatrice sur laquelle la plaque est placée conduit à un écoulement multidirectionnel de faible magnitude (LMMF, ou flux putativement pro-athérogène) au centre et à un écoulement uniaxial de magnitude élevée (HMUF, ou flux putativement athéroprotecteur) au bord des puits d’une plaque de 6 puits. Par exemple, la contrainte de cisaillement de la paroi moyenne dans le temps (TAWSS) est d’environ 0,3 Pa au centre et de 0,7 Pa au bord d’une plaque à 6 puits tourbillonnante à 150 tr/min avec un rayon orbital de 5 mm^{de 13.} La méthode ne nécessite que de la vaisselle disponible dans le commerce et le shaker orbital lui-même.

Il y a cependant un inconvénient à la méthode (et à d’autres méthodes d’imposition des écoulements in vitro) : les CE libèrent des médiateurs solubles et des microparticules de manière dépendante du cisaillement^14,15,16 et ce sécrétome peut affecter les CE dans des régions du puits autres que celle dans laquelle ils ont été libérés, en raison du mélange dans le milieu tourbillonnant. Ceci peut masquer les effets réels de l’effort de cisaillement sur le phénotype d’EC. Par exemple, Ghim et al. ont émis l’hypothèse que cela explique l’influence apparemment identique de différents profils de cisaillement sur le transport transcellulaire de grosses particules^17.

Ici nous décrivons une méthode pour favoriser l’adhérence endothéliale humaine de cellules de veine ombilicale (HUVEC) dans des régions spécifiques d’un plat de 6 puits utilisant le revêtement de fibronectin tout en utilisant pluronique F-127 pour passivate la surface et empêcher la croissance ailleurs. La méthode résout la limitation décrite ci-dessus car, en segmentant la croissance cellulaire, les CE n’éprouvent qu’un seul type de profil de cisaillement et ne sont pas influencés par les sécrétomes des CE exposés à d’autres profils ailleurs dans le puits.

Protocol

1. Fabrication de dispositifs et préparation de réactifs Fabrication d’un module en acier inoxydable Fabriquer le module en acier inoxydable à partir d’un acier inoxydable de nuance 316 à l’aide d’une fraiseuse CNC selon le dessin technique fourni(figure 1). Impression 3D d’un moule en polydiméthylsiloxane (PDMS) Préparez un modèle de conception assistée par ordinateur (CAO) 3D du moule PDMS à l’aide de SolidWorks conform?…

Representative Results

L’adhérence de HUVECs aux régions du plat de puits non revêtues de fibronectin a été abrogée par passivation pluronique F-127 ; La croissance a été confinée à la région recouverte de fibronectine même après 72 h de culture, avec et sans application de contrainte de cisaillement(figure 4A, figure 4C). Sans la passivation pluronique F-127, les HUVECs se sont fixés à la surface sans fibronectine et avaient prolifér…

Discussion

La méthode des puits tourbillonnants est capable de générer des profils d’écoulement complexes dans un seul puits – flux multidirectionnel de faible magnitude (LMMF) au centre et écoulement uniaxial de haute magnitude (HMUF) au bord du puits. Cependant, les sécrétions médiées par le stress de cisaillement du médiateur soluble seront mélangées dans le milieu tourbillonnant et affecteront les cellules de l’ensemble du puits, masquant potentiellement le véritable effet d’un profil de stress de cisaillemen…

Materials

Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)	Lonza	cc-3162
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	NA	NA	Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital
Reagents and Materials
Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG	Thermofisher Scientific	A11008
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated	Scientific Laboratory Supplies Ltd	351146
Fibronectin from Bovine Plasma	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Phosphate-Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Recombinant Human TNF-a	Peprotech	300-01A
RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg	RS	832-0264
Stainless Steel 316	Metal Supermarket	NA
Sylgard184 Silicone Elastomer kit	Farnell	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody	Cell Signaling Technology	13663
DRAQ5 (5mM)	Bio Status	DR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10i	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SHA7930
Leica TCS SP5 Confocal Microscope	Leica	NA
Retaining Ring Pliers	Misumi	RTWP32-58
Retaining Rings/Internal/C-Type	Misumi	RTWS35
Ultimaker 2+3-D printer	Ultimaker	NA
Softwares
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	The MathWorks	NA
Solidworks 2016	Dassault Systemes	NA