Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die Scherspannungsanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken.
Abstract
Scherspannung, die der Arterienwand durch den Blutfluss auferlegt wird, beeinflusst die Morphologie und Funktion der Endothelzellen. Niedrige Magnitude, oszillatorische und multidirektionale Scherspannungen wurden alle postuliert, um einen pro-atherosklerotischen Phänotyp in Endothelzellen zu stimulieren, während hohe Magnituden und unidirektionale oder einachsige Scherungen die endotheliale Homöostase fördern. Diese Hypothesen erfordern weitere Untersuchungen, aber traditionelle In-vitro-Techniken haben Einschränkungen und sind besonders schlecht darin, zellen multidirektionale Scherspannungen aufzuerlegen.
Eine Methode, die zunehmend eingesetzt wird, ist die Kultierung von Endothelzellen in Standard-Multi-Well-Platten auf der Plattform eines Orbitalschüttlers; Bei dieser einfachen, kostengünstigen, hochdurchsatzreichen und chronischen Methode erzeugt das wirbelnde Medium in verschiedenen Teilen des Bohrbrunnens unterschiedliche Muster und Größen der Scherung, einschließlich multidirektionaler Scherung. Es hat jedoch eine signifikante Einschränkung: Zellen in einer Region, die einer Art von Fluss ausgesetzt sind, können Mediatoren in das Medium freisetzen, die Zellen in anderen Teilen des Brunnens betreffen, die verschiedenen Strömungen ausgesetzt sind, wodurch die scheinbare Beziehung zwischen Fluss und Phänotyp verzerrt wird.
Hier stellen wir eine einfache und kostengünstige Modifikation der Methode vor, die es ermöglicht, Zellen nur bestimmten Scherspannungseigenschaften auszustellen. Die Zellaussaat wird auf einen definierten Bereich der Vertiefung beschränkt, indem der interessierende Bereich mit Fibronektin beschichtet wird, gefolgt von der Passivierung mit passivierender Lösung. Anschließend können die Platten auf dem Shaker verwirbelt werden, was dazu führt, dass die Zellen je nach Standort gut definierten Scherprofilen wie multidirektionaler Scherung niedriger Größe oder einachsiger Scherung hoher Größe ausgesetzt werden. Die Verwendung von Standard-Zellkultur-Kunststoffwaren ermöglicht nach wie vor eine einfache weitere Analyse der Zellen. Die Modifikation hat bereits den Nachweis löslicher Mediatoren ermöglicht, die unter definierten Scherspannungseigenschaften aus dem Endothel freigesetzt werden und Zellen an anderer Stelle im Bohrplatz beeinflussen.
Introduction
Reaktionen von Gefäßzellen auf ihre mechanische Umgebung sind wichtig für die normale Funktion der Blutgefäße und für die Entwicklung von Krankheiten1. Die Mechanobiologie der Endothelzellen (ECs), die die innere Oberfläche aller Blutgefäße auskleiden, war ein besonderer Schwerpunkt der mechanoobiologischen Forschung, da ECs direkt den Scherstress erfahren, der durch den Blutfluss über sie erzeugt wird. Verschiedene phänotypische Veränderungen wie Entzündungsreaktionen, veränderte Steifigkeit und Morphologie, die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und die Lokalisation und Expression von Junctionalproteinen hängen von der EC-Exposition gegenüber Scherstressab 2,3,4. Scherabhängige endotheliale Eigenschaften können auch für die lückenhafte Entwicklung von Krankheiten wie Atherosklerose verantwortlich sein5,6,7.
Es ist nützlich, die Wirkung der Scherung auf ECs in Kultur zu untersuchen, wo Spannungen kontrolliert werden können und ECs von anderen Zelltypen isoliert werden können. Häufig verwendete In-vitro-Geräte zum Anwenden von Scherspannungen auf ECs umfassen die Parallelplattenflusskammer und das Kegel-Platten-Viskosimeter, aber nur einachsige stetige, oszillierende und pulsierende Strömung kann angewendet werden8,9. Zwar wurden modifizierte Strömungskammern mit konischen oder verzweigten Geometrien und mikrofluidischen Chips entwickelt, die eine stenotische Geometrie nachahmen, ihr geringer Durchsatz und die relativ kurze Kulturdauer, die möglich ist, stellen jedoch eine Herausforderung dar10, 11.
Die Orbital-Shaker-Methode (oder Swirling Well) zur Untersuchung der endothelialen Mechanotransduktion, bei der Zellen in Standard-Zellkultur-Kunststoffware auf der Plattform eines Orbital-Shakers gezüchtet werden, gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, da sie in der Lage ist, komplexe, räumlich variierende Scherspannungsmuster auf ECs mit hohem Durchsatz chronisch aufzuzwingen (siehe Review von Warboys et al.12). CFD-Simulationen (Computational Fluid Dynamics) wurden eingesetzt, um die räumliche und zeitliche Variation der Scherspannung in einem wirbelnden Brunnen zu charakterisieren. Die wirbelnde Bewegung des Kulturmediums, die durch die Orbitalbewegung der Shakerplattform verursacht wird, auf der die Platte platziert ist, führt zu Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF oder angeblich pro-atherogener Strömung) in der Mitte und High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF oder angeblich atheroprotektive Strömung) am Rand der Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Zum Beispiel beträgt die zeitgemittelte Wandscherspannung (TAWSS) ungefähr 0,3 Pa in der Mitte und 0,7 Pa am Rand einer 6-Well-Platte, die bei 150 U / min mit einem 5 mm Orbitalradius13verwirbelt wird. Das Verfahren erfordert nur handelsübliche Kunststoffware und den Orbitalshatterer selbst.
Es gibt jedoch einen Nachteil der Methode (und anderer Methoden zur Auferlegung von Strömungen in vitro): ECs setzen lösliche Mediatoren und Mikropartikel scherabhängig frei14 , 15,16und dieses Sekretom kann ECs in anderen Bereichen des Brunnens als dem, in dem sie freigesetzt wurden, aufgrund der Vermischung im wirbelnden Medium beeinflussen. Dies kann die tatsächlichen Auswirkungen von Scherspannung auf den EC-Phänotyp verschleiern. So haben Ghim et al. spekuliert, dass dies den scheinbar identischen Einfluss verschiedener Scherprofile auf den transzellulären Transport großer Teilchenerklärt 17.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Förderung der Adhäsion menschlicher Nabelschnurvenendothelzellen (HUVEC) in bestimmten Regionen einer 6-Well-Platte unter Verwendung einer Fibronektinbeschichtung unter Verwendung von Pluronic F-127, um die Oberfläche zu passivieren und das Wachstum an anderer Stelle zu verhindern. Die Methode löst die oben beschriebene Einschränkung auf, da ECs durch die Segmentierung des Zellwachstums nur eine Art von Scherprofil erfahren und nicht durch Sekretome von ECs beeinflusst werden, die anderen Profilen an anderer Stelle im Bohrfeld ausgesetzt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Swirling-Well-Methode ist in der Lage, komplexe Strömungsprofile in einer einzigen Bohrung zu erzeugen – Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in der Mitte und High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) am Rand des Bohrstücks. Scherstressvermittelte Sekrete löslicher Mediatoren werden jedoch in das wirbelnde Medium gemischt und beeinflussen Zellen im gesamten Brunnen, wodurch möglicherweise die wahre Wirkung eines bestimmten Scherspannungsprofils auf die Zellen maskiert wird.
Das hier de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken einem Projektzuschuss der British Heart Foundation (an PDW), einem National Medical Research Council Singapore TAAP und DYNAMO Grant (an XW, NMRC / OFLCG / 004 / 2018, NMRC / OFLCG / 001 / 2017), einem A * STAR Graduate Scholarship (an KTP) und einem British Heart Foundation Center of Research Excellence Studentship (an MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
Referências
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