Сегментирование роста эндотелиальных клеток в 6-луночных пластинах на орбитальном шейкере для механобиологических исследований
Summary
Этот протокол описывает метод покрытия для ограничения роста эндотелиальных клеток определенной областью 6-луночной пластины для применения напряжения сдвига с использованием модели орбитального шейкера.
Abstract
Напряжение сдвига, накладывало на артериальную стенку потоком крови, влияет на морфологию и функцию эндотелиальных клеток. Низкая величина, колебательные и разнонаправленные сдвиговые напряжения были постулированы для стимуляции проатеросклеротического фенотипа в эндотелиальных клетках, тогда как считается, что высокая величина и однонаправленный или одноосный сдвиг способствуют эндотелиальному гомеостазу. Эти гипотезы требуют дальнейшего изучения, но традиционные методы in vitro имеют ограничения и особенно плохо налагают разнонаправленные сдвиговые нагрузки на клетки.
Одним из методов, который получает все большее применение, является культивирования эндотелиальных клеток в стандартных многоскваженных пластинах на платформе орбитального шейкера; в этом простом, недорогом, высокопроизводительном и хроническом методе закручивающаяся среда производит различные узоры и величины сдвига, включая разнонаправленный сдвиг, в разных частях скважины. Однако он имеет существенное ограничение: клетки в одной области, подвергаясь воздействию одного типа потока, могут высвобождать медиаторы в среду, которые влияют на клетки в других частях скважины, подвергаясь воздействию различных потоков, тем самым искажая кажущуюся связь между потоком и фенотипом.
Здесь мы представляем простую и доступную модификацию метода, которая позволяет клеткам подвергаться воздействию только определенных характеристик напряжения сдвига. Посев клеток ограничивается определенной областью скважины путем покрытия интересующей области фибронектином с последующей пассивацией с использованием пассивационного раствора. Впоследствии пластины могут закручиваться на шейкере, что приводит к воздействию на клетки четко определенных профилей сдвига, таких как многонаправленный сдвиг низкой величины или одноосный сдвиг высокой величины, в зависимости от их местоположения. Как и прежде, использование стандартной пластиковой посуды для клеточных культур позволяет легко продолжить анализ клеток. Модификация уже позволила продемонстрировать растворимые медиаторы, высвобождаемые из эндотелия при определенных характеристиках сдвигового напряжения, которые влияют на клетки, расположенные в другом месте скважины.
Introduction
Реакции сосудистых клеток на их механическую среду важны в нормальной функции кровеносных сосудов и в развитии заболевания1. Механобиология эндотелиальных клеток (ЭК), которые выстилают внутреннюю поверхность всех кровеносных сосудов, была в центре внимания механобиологических исследований, потому что ЭК непосредственно испытывают напряжение сдвига, создаваемое кровотоком над ними. Различные фенотипические изменения, такие как воспалительные реакции, измененная жесткость и морфология, высвобождение вазоактивных веществ, а также локализация и экспрессия соединительных белков зависят от воздействия EC на сдвиговое напряжение2,3,4. Сдвигозависимые эндотелиальные свойства могут также объяснять неоднородное развитие таких заболеваний, как атеросклероз5,6,7.
Полезно изучать влияние сдвига на ЭК в культуре, где стрессы можно контролировать, а ЭК можно выделить из других типов клеток. Обычно используемые устройства in vitro для применения напряжения сдвига к ЭК включают параллельно пластинчатую проточную камеру и конусно-пластинчатый вискозиметр, но может быть применен только одноосный устойчивый, колебательный и пульсирующий поток8,9. Хотя были разработаны модифицированные проточные камеры с конической или ветвящейся геометрией и микрофлюидные чипы, имитирующие стенотическую геометрию, их низкая пропускная способность и относительно короткая продолжительность культивирования, которая возможна, представляют собой проблему10, 11.
Орбитальный шейкер (или закручивающийся колодец) метод исследования эндотелиальной механотрансдукции, при котором клетки выращиваются в стандартной пластичной посуде для клеточных культур, помещенной на платформу орбитального шейкера, привлекает все большее внимание, поскольку он способен хронически накладывать сложные, пространственно изменяющиеся паттерны напряжения сдвига на ЭК с высокой пропускной способностью (см. обзор Warboys et al.12). Моделирование вычислительной гидродинамики (CFD) было использовано для характеристики пространственного и временного изменения напряжения сдвига в закрученной скважине. Закручивающееся движение культуральной среды, вызванное орбитальным движением шейкеровой платформы, на которой размещена плита, приводит к низкоразмерному многонаправленному потоку (LMMF, или мнимно проатерогенному потоку) в центре и одноосному потоку высокой величины (HMUF, или мнимому атеропротекторному потоку) на краю скважин 6-луночной пластины. Например, усредненное по времени напряжение сдвига стенки (TAWSS) составляет примерно 0,3 Па в центре и 0,7 Па на краю 6-луночной пластины, закрученной со скоростью 150 об/мин с радиусом орбиты 5 мм13. Метод требует только коммерчески доступной пластиковой посуды и самого орбитального шейкера.
Существует, однако, недостаток метода (и других методов наложения потоков in vitro): ЭК высвобождают растворимые медиаторы и микрочастицы в зависимости отсдвига14, 15,16, и этот секретом может влиять на ЭК в областях скважины, отличных от той, в которой они были высвобождаются, из-за перемешивания в закручивающейся среде. Это может маскировать фактическое влияние сдвигового стресса на фенотип EC. Например, Ghim et al. предположили, что это объясняет, по-видимому, идентичное влияние различных профилей сдвига на трансклеточный транспорт крупных частиц17.
Здесь мы описываем метод содействия адгезии эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVEC) в определенных областях 6-скважинной пластины с использованием фибронектинового покрытия при использовании Pluronic F-127 для пассивации поверхности и предотвращения роста в других местах. Метод устраняет ограничение, описанное выше, поскольку, сегментируя рост клеток, ЭК испытывают только один вид профиля сдвига и не подвержены влиянию секретомов из ЭК, подвергающихся воздействию других профилей в других местах скважины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод закрученной скважины способен генерировать сложные профили потока в одной скважине – низкоразмерный разнонаправленный поток (LMMF) в центре и одноосный поток высокой величины (HMUF) на краю скважины. Однако сдвиговые стресс-опосредованные выделения растворимого медиатора будут сме?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью отмечают грант проекта Британского фонда сердца (PDW), грант Национального совета медицинских исследований Сингапура TAAP и DYNAMO (XW, NMRC / OFLCG / 004/2018, NMRC / OFLCG / 001/ 2017), стипендию A*STAR для выпускников (для KTP) и студенчество Британского центра исследований Сердца (для MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
Referências
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
