Kvantitativ Proteomics Workflow ved hjælp af flere reaktionsovervågningsbaserede detektioner af proteiner fra humant hjernevæv
Summary
Protokollen har til formål at indføre brugen af et tredobbelt firdobbelt massespektrometer til multireaktionsovervågning (MRM) af proteiner fra kliniske prøver. Vi har leveret en systematisk arbejdsgang fra prøveforberedelse til dataanalyse for kliniske prøver med alle de nødvendige forholdsregler, der skal træffes.
Abstract
Den proteomic analyse af det menneskelige hjernevæv i løbet af det sidste årti har i høj grad forbedret vores forståelse af hjernen. Men hjernerelaterede lidelser fortsætter med at være en stor bidragyder af dødsfald rundt om i verden, hvilket kræver behovet for endnu større forståelse af deres patobiologi. Traditionelle antistofbaserede teknikker som vestlig blotting eller immunohistochemistry lider af at være lav gennemstrømning ud over at være arbejdskrævende og kvalitativ eller semi-kvantitativ. Selv konventionelle massespektrometri-baserede shotgun tilgange undlader at give afgørende beviser til støtte for en vis hypotese. Målrettede proteomics tilgange er stort set hypotese drevet og adskiller sig fra de konventionelle shotgun proteomics tilgange, der har været længe i brug. Flere reaktionsovervågning er en sådan målrettet tilgang, der kræver brug af et specielt massespektrometer kaldet tandem firedobbelt massespektrometer eller tredobbelt firdobbelt massespektrometer. I den aktuelle undersøgelse har vi systematisk fremhævet de vigtigste skridt, der er involveret i at udføre en vellykket tandem firedobbelt massespektrometri-baseret proteomics workflow ved hjælp af humant hjernevæv med det formål at introducere denne arbejdsgang til et bredere forskningsmiljø.
Introduction
I løbet af det sidste årti har den hurtige udvikling inden for massespektrometri (MS) kombineret med øget forståelse af kromatografiteknikker i høj grad bidraget til at fremme MS-baserede proteomik. Molekylærbiologi-baserede teknikker såsom vestlige blotting og immunohistochemistry har længe lidt af reproducerbarhed spørgsmål, langsom ekspeditionstid, inter-observatør variation og deres manglende evne til præcist at kvantificere proteiner, for at nævne nogle få. Til dette formål fortsætter den overlegne følsomhed af højoverførselsproteomics tilgange med at tilbyde molekylærbiologer et alternativt og mere pålideligt værktøj i deres søgen efter bedre at forstå proteinernes roller i celler. Men shotgun proteomics tilgange (Data afhængige Acquisition eller DDA) ofte undlader at opdage lav rigelige proteiner i komplekse væv ud over at være stærkt afhængige af følsomhed og opløsning af instrumentet. I løbet af de sidste par år har laboratorier rundt om i verden udviklet teknikker som Data Independent Acquisition (DIA), der kræver øget computerkraft og pålidelig software, der kan håndtere disse meget komplekse datasæt. Disse teknikker er dog stadig et igangværende arbejde og ikke særlig brugervenlige. Målrettede MS-baserede proteomics tilgange giver en perfekt balance mellem den høje gennemstrømning karakter af MS tilgange og følsomheden af molekylærbiologi tilgange som ELISA. Et målrettet massespektrometribaseret proteomics-eksperiment fokuserer på at detektere hypotesedrevne proteiner eller peptider fra opdagelsesbaserede shotgun proteomics-eksperimenter eller gennem tilgængelig litteratur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) er en sådan målrettet MS-tilgang, der bruger et tandem firedobbelt massespektrometer til nøjagtig detektion og kvantificering af proteiner / peptider fra komplekse prøver. Teknikken giver højere følsomhed og specificitet på trods af, at det kræver brug af et instrument med lav opløsning.
En quadrupole er lavet af 4 parallelle stænger, med hver stang forbundet til diagonalt modsatte stang. Et svingende felt skabes mellem de firedobbelte stænger ved at anvende vekslende RF- og DC-spændinger. Ionernes bane inde i quadrupole påvirkes af tilstedeværelsen af de samme spændinger på tværs af modsatte stænger. Ved at anvende RF til DC spænding, kan bane af ioner stabiliseres. Det er denne egenskab af quadrupole, der gør det muligt at bruge det som en masse filter, som selektivt kan lade specifikke ioner til at passere igennem. Afhængigt af behovet kan en firdoblet betjenes i enten statisk tilstand eller scanningstilstand. Den statiske tilstand tillader kun ioner med en bestemt m/ z at passere igennem, hvilket gør tilstanden meget selektiv og specifik for interessen. Scanningstilstanden på den anden side gør det muligt for ioner på tværs af hele m/ z-området at passere igennem. Således kan tandem firdobbelen massespektrometre fungere på 4 mulige måder: i) den første firdobbelige drift i statisk tilstand, mens den anden opererer i scanningstilstand; ii) den første firdobbeler, der kører i scanningstilstand, mens den anden arbejder i statisk tilstand iii) begge quadrupoles, der opererer i scanningstilstand; og iv) begge quadrupoles, der opererer i statisk tilstand3. I et typisk MRM-eksperiment opererer begge quadrupoler i statisk tilstand, så specifikke prækursorer og deres resulterende produkter efter fragmentering kan overvåges. Dette gør teknikken meget følsom og selektiv, hvilket giver mulighed for nøjagtig kvantificering.
For molekylærbiologer er det menneskelige hjernevæv og dets celler en guldgrube. Disse bemærkelsesværdige enheder af et stadigt interessant organ i den menneskelige krop kan give molekylær og cellulær indsigt i dens funktion. Proteomic undersøgelser af hjernevævet kan ikke kun hjælpe os med at forstå den systemiske funktion af en sund hjerne, men også de cellulære veje, der bliver dysreguleret, når de påføres af en vis sygdom4. Hjernevævet med al dets heterogenitet er imidlertid et meget komplekst organ at analysere og kræver en samordnet tilgang til en bedre forståelse af ændringerne på molekylært niveau. Følgende arbejde beskriver hele arbejdsgangen, der starter lige fra udvinding af proteiner fra hjernevæv, oprettelse og optimering af metoderne til MRM-analyse til validering af målene (Figur 1). Her har vi systematisk fremhævet de store skridt, der er involveret i et vellykket MRM-baseret eksperiment ved hjælp af menneskeligt hjernevæv med det formål at introducere teknikken og dens udfordringer til et bredere forskningsmiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikker som Immunohistochemistry og vestlig blotting blev betragtet som guldstandarder for validering af proteinmål i mange år. Disse metoder finder anvendelse selv i dag med mindre ændringer i protokollen og ringe afhængighed af teknologi, hvilket gør dem meget besværlige og kedelige. Derudover involverer de også brug af dyre antistoffer, som ikke altid viser den samme specificitet på tværs af partier og kræver stor ekspertise. Derudover har kun en lille brøkdel af proteiner, der er identificeret ved hjæl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility hos IIT Bombay støttet af Institut for Bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) til at udføre alle MS-relaterede eksperimenter.
Vi vil gerne rette en særlig tak til Mr. Rishabh Yadav for at lave og redigere hele videoen og Mr. Nishant Nerurkar for hans arbejde med at redigere lyden.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referências
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Bioquímica. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
