Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain
Summary
Le protocole vise à introduire l’utilisation d’un spectromètre de masse triple quadripolaire pour la surveillance des réactions multiples (MRM) des protéines provenant d’échantillons cliniques. Nous avons fourni un flux de travail systématique allant de la préparation des échantillons à l’analyse des données pour les échantillons cliniques avec toutes les précautions nécessaires à prendre.
Abstract
L’analyse protéomique du tissu cérébral humain au cours de la dernière décennie a grandement amélioré notre compréhension du cerveau. Cependant, les troubles liés au cerveau continuent d’être un contributeur majeur de décès dans le monde, nécessitant la nécessité d’une compréhension encore plus grande de leur pathobiologie. Les techniques traditionnelles à base d’anticorps comme le western blotting ou l’immunohistochimie souffrent d’un faible débit en plus d’être à forte intensité de main-d’œuvre et qualitatives ou semi-quantitatives. Même les approches conventionnelles basées sur la spectrométrie de masse au fusil de chasse ne parviennent pas à fournir des preuves concluantes à l’appui d’une certaine hypothèse. Les approches protéomiques ciblées sont largement fondées sur des hypothèses et diffèrent des approches protéomiques conventionnelles qui ont été utilisées depuis longtemps. La surveillance des réactions multiples est l’une de ces approches ciblées qui nécessite l’utilisation d’un spectromètre de masse spécial appelé spectromètre de masse quadripolaire tandem ou spectromètre de masse triple quadripolaire. Dans la présente étude, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes impliquées dans la réalisation réussie d’un flux de travail protéomique basé sur la spectrométrie de masse quadripolaire en tandem en utilisant du tissu cérébral humain dans le but d’introduire ce flux de travail dans une communauté de recherche plus large.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, les développements rapides de la spectrométrie de masse (SEP) associés à une meilleure compréhension des techniques de chromatographie ont grandement contribué à l’avancement de la protéomique basée sur la SEP. Les techniques basées sur la biologie moléculaire telles que le transfert de Western et l’immunohistochimie souffrent depuis longtemps de problèmes de reproductibilité, de délais d’exécution lents, de variabilité entre observateurs et de leur incapacité à quantifier avec précision les protéines, pour n’en nommer que quelques-unes. À cette fin, la sensibilité supérieure des approches protéomiques à haut débit continue d’offrir aux biologistes moléculaires un outil alternatif et plus fiable dans leur quête pour mieux comprendre les rôles des protéines dans les cellules. Cependant, les approches protéomiques au fusil de chasse (Acquisition dépendante des données ou DDA) ne parviennent souvent pas à détecter les protéines faiblement abondantes dans les tissus complexes en plus d’être fortement dépendantes de la sensibilité et de la résolution de l’instrument. Au cours des deux dernières années, des laboratoires du monde entier ont développé des techniques telles que l’acquisition indépendante des données (DIA) qui nécessitent une puissance de calcul accrue et des logiciels fiables pouvant gérer ces ensembles de données très complexes. Cependant, ces techniques sont encore un travail en cours et peu conviviales. Les approches protéomiques ciblées basées sur la SEP offrent un équilibre parfait entre la nature à haut débit des approches MS et la sensibilité des approches de biologie moléculaire comme ELISA. Une expérience protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse se concentre sur la détection de protéines ou de peptides basés sur des hypothèses à partir d’expériences protéomiques basées sur la découverte ou dans la littérature disponible1,2. La surveillance des réactions multiples (MRM) est l’une de ces approches ciblées de SEP qui utilise un spectromètre de masse quadripolaire en tandem pour la détection et la quantification précises des protéines / peptides à partir d’échantillons complexes. La technique offre une sensibilité et une spécificité plus élevées malgré l’utilisation d’un instrument à basse résolution.
Un quadripôle est composé de 4 tiges parallèles, chaque tige 1 nouant une connexion à la tige diagonalement opposée. Un champ fluctuant est créé entre les tiges quadripolaire en appliquant des tensions RF et CC alternées. La trajectoire des ions à l’intérieur du quadripôle est influencée par la présence des mêmes tensions sur les tiges opposées. En appliquant la RF à la tension continue, la trajectoire des ions peut être stabilisée. C’est cette propriété du quadripôle qui lui permet d’être utilisé comme filtre de masse qui peut sélectivement laisser passer des ions spécifiques. Selon les besoins, un quadripôle peut être utilisé en mode statique ou en mode de numérisation. Le mode statique ne laisse passer que les ions avec un m/z spécifié, ce qui rend le mode très sélectif et spécifique à l’ion d’intérêt. Le mode de balayage, d’autre part, permet aux ions de traverser toute la gamme m / z. Ainsi, les spectromètres de masse quadripolaire tandem peuvent fonctionner de 4 manières possibles : i) le premier quadripolaire fonctionnant en mode statique tandis que le second fonctionnant en mode balayage ; ii) le premier quadripôle fonctionnant en mode de balayage tandis que le second fonctionnant en mode statique; iii) les deux quadripôles fonctionnant en mode de balayage; et iv) les deux quadripôles fonctionnant en mode statique3. Dans une expérience MRM typique, les deux quadripôles fonctionnent en mode statique, ce qui permet de surveiller des précurseurs spécifiques et leurs produits résultants après fragmentation. Cela rend la technique très sensible et sélective permettant une quantification précise.
Pour les biologistes moléculaires, le tissu cérébral humain et ses cellules sont un trésor. Ces unités remarquables d’un organe toujours intéressant du corps humain peuvent fournir des informations moléculaires et cellulaires sur son fonctionnement. Les investigations protéomiques du tissu cérébral peuvent non seulement nous aider à comprendre le fonctionnement systémique d’un cerveau sain, mais aussi les voies cellulaires qui sont dérégulées lorsqu’elles sont infligées par une maladie4. Cependant, le tissu cérébral avec toute son hétérogénéité est un organe très complexe à analyser et nécessite une approche concertée pour une meilleure compréhension des changements au niveau moléculaire. Les travaux suivants décrivent l’ensemble du flux de travail, depuis l’extraction des protéines du tissu cérébral, la création et l’optimisation des méthodes de dosage MRM, jusqu’à la validation des cibles (Figure 1). Ici, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes d’une expérience réussie basée sur la MRM utilisant du tissu cérébral humain dans le but de présenter la technique et ses défis à une communauté de recherche plus large.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des techniques telles que l’immunohistochimie et le Western blotting ont été considérées comme les étalons-or pour la validation des cibles protéiques pendant de nombreuses années. Ces méthodes trouvent une utilisation même aujourd’hui avec des modifications mineures dans le protocole et peu de dépendance à la technologie, ce qui les rend très lourdes et fastidieuses. En outre, ils impliquent également l’utilisation d’anticorps coûteux qui ne présentent pas toujours la même spécificité entre le…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le projet MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projet #34_IITB à SS et MASSFIITB Facility à IIT Bombay soutenu par le Département de biotechnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) pour mener à bien toutes les expériences liées à la SEP.
Nous remercions tout particulièrement M. Rishabh Yadav pour la réalisation et le montage de l’ensemble de la vidéo et M. Nishant Nerurkar pour son travail de montage audio.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referências
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