मानव मस्तिष्क ऊतक से प्रोटीन का एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी आधारित पता लगाने का उपयोग कर मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैदानिक नमूनों से प्रोटीन के मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) के लिए ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग शुरू करना है। हमने सभी आवश्यक सावधानियों के साथ नैदानिक नमूनों के लिए नमूना तैयारी से लेकर डेटा विश्लेषण तक एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रदान किया है।
Abstract
पिछले दशक में मानव मस्तिष्क के ऊतकों के प्रोटेओमिक विश्लेषण ने मस्तिष्क के बारे में हमारी समझ को बहुत बढ़ाया है। हालांकि, मस्तिष्क से संबंधित विकारों को दुनिया भर में मौतों का एक प्रमुख योगदानकर्ता बना हुआ है, उनके रोग विज्ञान की और भी अधिक समझ के लिए की जरूरत है । पश्चिमी ब्लॉटिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी पारंपरिक एंटीबॉडी-आधारित तकनीकें श्रम-प्रधान और गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक होने के अलावा कम थ्रूपुट होने से पीड़ित हैं। यहां तक कि पारंपरिक जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित शॉटगन दृष्टिकोण एक निश्चित परिकल्पना का समर्थन करने के लिए निर्णायक सबूत प्रदान करने में विफल रहे हैं। लक्षित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण काफी हद तक परिकल्पना से प्रेरित होते हैं और पारंपरिक शॉटगन प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों से भिन्न होते हैं जो लंबे समय तक उपयोग में रहे हैं। मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग ऐसा ही एक लक्षित दृष्टिकोण है जिसके लिए एक विशेष मास स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग की आवश्यकता होती है जिसे टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर या ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर कहा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने इस कार्यप्रवाह को व्यापक अनुसंधान समुदाय में पेश करने के उद्देश्य से मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करके एक सफल टैम्परपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का सफल प्रदर्शन करने में शामिल प्रमुख कदमों पर व्यवस्थित रूप से प्रकाश डाला है।
Introduction
पिछले दशक के दौरान, क्रोमेटोग्राफी तकनीकों की बढ़ती समझ के साथ-साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) में तेजी से विकास ने एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स की उन्नति में बहुत मदद की है। आणविक जीव विज्ञान आधारित तकनीकों जैसे पश्चिमी ब्लॉटिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री लंबे समय से प्रजनन के मुद्दों, धीमी गति से बदलाव के समय, अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता और प्रोटीन को सही मात्रा में निर्धारित करने में उनकी असमर्थता से पीड़ित हैं, कुछ नाम हैं। इस उद्देश्य के लिए, उच्च थ्रूपुट प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों की बेहतर संवेदनशीलता कोशिकाओं में प्रोटीन की भूमिकाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए आणविक जीवविज्ञानियों को उनकी खोज में एक वैकल्पिक और अधिक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करती रहती है। हालांकि, शॉटगन प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण (डेटा निर्भर अधिग्रहण या डीडीए) अक्सर उपकरण की संवेदनशीलता और संकल्प पर भारी निर्भर होने के अलावा जटिल ऊतकों में कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने में विफल रहते हैं। पिछले कुछ वर्षों में, दुनिया भर की प्रयोगशालाएं डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) जैसी तकनीकों का विकास कर रही हैं जिनके लिए बढ़ी हुई कंप्यूटिंग शक्ति और विश्वसनीय सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है जो इन अत्यधिक जटिल डेटासेट को संभाल सकते हैं। हालांकि, इन तकनीकों को अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे है और बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं है । लक्षित एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण एमएस दृष्टिकोणों की उच्च थ्रूपुट प्रकृति और एलिसा जैसे आणविक जीव विज्ञान दृष्टिकोणों की संवेदनशीलता के बीच एक आदर्श संतुलन प्रदान करते हैं। एक लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स प्रयोग खोज आधारित शॉटगन प्रोटेओमिक्स प्रयोगों से या उपलब्ध साहित्य1,2के माध्यम से परिकल्पना चालित प्रोटीन या पेप्टाइड्स का पता लगाने पर केंद्रित है। मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) ऐसा ही एक लक्षित एमएस दृष्टिकोण है जो जटिल नमूनों से प्रोटीन/पेप्टाइड्स का सटीक पता लगाने और मात्राकरण के लिए एक मिलकर क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करता है । तकनीक कम संकल्प वाले उपकरण के उपयोग की आवश्यकता के बावजूद उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करती है।
एक चतुर्भुज 4 समानांतर छड़ से बना है, जिसमें प्रत्येक रॉड तिरछे विपरीत रॉड से जुड़ा होता है। बारी आरएफ और डीसी वोल्टेज लगाने से क्वाड्रपोल छड़ के बीच एक उतार-चढ़ाव वाला क्षेत्र बनाया जाता है। क्वाड्रपोल के अंदर आयनों का प्रक्षेपवक्र विपरीत छड़ों में एक ही वोल्टेज की उपस्थिति से प्रभावित होता है। डीसी वोल्टेज के लिए आरएफ लागू करके, आयनों की गति को स्थिर किया जा सकता है। यह चतुर्भुज की यह संपत्ति है जो इसे एक बड़े पैमाने पर फ़िल्टर के रूप में उपयोग करने की अनुमति देती है जो चुनिंदा विशिष्ट आयनों को पारित करने दे सकती है। आवश्यकता के आधार पर, एक क्वाड्रपोल को या तो स्थिर मोड या स्कैनिंग मोड में संचालित किया जा सकता है। स्थिर मोड केवल एक निर्दिष्ट एम/जेड के साथ आयनों को पारित करने की अनुमति देता है, जिससे मोड अत्यधिक चयनात्मक और ब्याज के आयन के लिए विशिष्ट हो जाता है। दूसरी ओर स्कैनिंग मोड पूरे एम/जेड रेंज में आयनों के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर 4 संभावित तरीकों से काम कर सकते हैं: i) पहला क्वाड्रपोल स्थिर मोड में काम कर रहा है जबकि दूसरा स्कैनिंग मोड में काम कर रहा है; ii) स्कैनिंग मोड में पहला क्वाड्रपोल काम कर रहा है जबकि दूसरा स्थिर मोड में काम कर रहा है; iii) स्कैनिंग मोड में काम करने वाले दोनों क्वाड्रपोल; और iv) स्टेटिक मोड3में काम कर रहे दोनों क्वाड्रपोल्स . एक विशिष्ट एमआरएम प्रयोग में, दोनों क्वाड्रपोल स्थिर मोड में काम करते हैं जो विखंडन के बाद विशिष्ट अग्रदूतों और उनके परिणामस्वरूप उत्पादों की निगरानी करने की अनुमति देते हैं। यह तकनीक को सटीक मात्राकरण की अनुमति देने के लिए बहुत संवेदनशील और चयनात्मक बनाता है।
आणविक जीव विज्ञानियों के लिए, मानव मस्तिष्क ऊतक और इसकी कोशिकाएं एक खजाना निधि हैं। मानव शरीर के एक कभी दिलचस्प अंग की ये उल्लेखनीय इकाइयां अपने कामकाज में आणविक और सेलुलर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं। मस्तिष्क के ऊतकों की प्रोटेओमिक जांच न केवल हमें स्वस्थ मस्तिष्क के प्रणालीगत कामकाज को समझने में मदद कर सकती है बल्कि सेलुलर रास्ते भी जो किसी बीमारी द्वारा दिए जाने परडिसेलेटहो जाते हैं 4 । हालांकि, अपनी सभी विषमता के साथ मस्तिष्क ऊतक विश्लेषण करने के लिए एक बहुत ही जटिल अंग है और आणविक स्तर पर परिवर्तन की बेहतर समझ के लिए एक ठोस दृष्टिकोण की आवश्यकता है। निम्नलिखित कार्य मस्तिष्क के ऊतकों से प्रोटीन निकालने, एमआरएम परख के तरीकों को बनाने और अनुकूलित करने, लक्ष्यों के सत्यापन(चित्रा 1)से शुरू होने वाले पूरे कार्यप्रवाह का वर्णन करता है। यहां, हमने एक व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए तकनीक और इसकी चुनौतियों को पेश करने के उद्देश्य से मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करके एक सफल एमआरएम आधारित प्रयोग में शामिल प्रमुख कदमों पर व्यवस्थित रूप से प्रकाश डाला है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसी तकनीकों को कई वर्षों तक प्रोटीन लक्ष्यों के सत्यापन के लिए सोने के मानकों के रूप में माना जाता था। इन तरीकों प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों और प्रौ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एमएस से संबंधित सभी प्रयोगों को पूरा करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग (बीटी/PR13114/INF/22/206/2015) द्वारा समर्थित आईआईटी बॉम्बे में एसएस और मासफिट्ब सुविधा के लिए #34_IITB एमएचआरडी-यूएवाई परियोजना (उछतर एविक योजना) को स्वीकार करते हैं ।
हम पूरे वीडियो को बनाने और संपादित करने के लिए श्री ऋषभ यादव और श्री निशांत नेरुरकर को ऑडियो के संपादन में उनके काम के लिए अपना विशेष धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referências
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