Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad
Summary
Protokollet syftar till att införa användning av en trippel fyrdubbel masspektrometer för multipla reaktionsövervakning (MRM) av proteiner från kliniska prover. Vi har tillhandahållit ett systematiskt arbetsflöde från provberedning till dataanalys för kliniska prover med alla nödvändiga försiktighetsåtgärder som ska vidtas.
Abstract
Den proteomiska analysen av den mänskliga hjärnvävnaden under det senaste decenniet har kraftigt förbättrat vår förståelse av hjärnan. Hjärnrelaterade sjukdomar fortsätter dock att vara en stor bidragande orsak till dödsfall runt om i världen, vilket kräver behovet av ännu större förståelse för deras patobiologi. Traditionella antikroppsbaserade tekniker som western blotting eller immunohistochemistry lider av att vara låggenomströmning förutom att vara arbetsintensiva och kvalitativa eller semikvantitativa. Även konventionella masspektrometribaserade hagelgevärsmetoder misslyckas med att ge avgörande bevis för att stödja en viss hypotes. Riktade proteomics metoder är till stor del hypotesdrivna och skiljer sig från konventionella hagelgevär proteomics metoder som har använts länge. Övervakning av flera reaktioner är en sådan riktad metod som kräver användning av en speciell masspektrometer som kallas tandem fyrdubbel masspektrometer eller trippel fyrdubbel masspektrometer. I den aktuella studien har vi systematiskt lyft fram de viktigaste stegen i att utföra ett framgångsrikt tandem fyrdubbelt masspektrometribaserat proteomikarbetsflöde med hjälp av mänsklig hjärnvävnad i syfte att introducera detta arbetsflöde till en bredare forskargemenskap.
Introduction
Under det senaste decenniet har den snabba utvecklingen inom masspektrometri (MS) i kombination med ökad förståelse för kromatografitekniker i hög grad bidragit till utvecklingen av MS-baserade proteomiker. Molekylärbiologiska tekniker som western blotting och immunohistochemistry har länge lidit av reproducerbarhetsproblem, långsam leveranstid, variabilitet mellan observatörer och deras oförmåga att exakt kvantifiera proteiner, för att nämna några. För detta ändamål fortsätter den överlägsna känsligheten hos proteomiska metoder med hög genomströmning att erbjuda molekylärbiologer ett alternativt och mer tillförlitligt verktyg i sin strävan att bättre förstå proteinernas roller i celler. Hagelgevärsproteomikmetoder (Data dependent Acquisition eller DDA) misslyckas dock ofta med att upptäcka låga rikliga proteiner i komplexa vävnader förutom att vara starkt beroende av instrumentets känslighet och upplösning. Under de senaste åren har labb runt om i världen utvecklat tekniker som Data Independent Acquisition (DIA) som kräver ökad datorkraft och pålitlig programvara som kan hantera dessa mycket komplexa datamängder. Dessa tekniker är dock fortfarande ett pågående arbete och inte särskilt användarvänligt. Riktade MS-baserade proteomikmetoder ger en perfekt balans mellan ms-metodernas höga genomströmningskaraktär och känsligheten hos molekylärbiologiska metoder som ELISA. Ett riktat masspektrometribaserat proteomikexperiment fokuserar på att upptäcka hypotesdrivna proteiner eller peptider från upptäcktsbaserade hagelgevärsproteomiska experiment eller genom tillgänglig litteratur1,2. Multipla reaktionsövervakning (MRM) är en sådan riktad MS-metod som använder en tandem fyrdubbel masspektrometer för korrekt detektion och kvantifiering av proteiner/peptider från komplexa prover. Tekniken ger högre känslighet och specificitet trots att det kräver användning av ett lågupplöst instrument.
En fyrdubbel är tillverkad av 4 parallella stavar, med varje stång ansluten till den diagonalt motsatta stången. Ett fluktuerande fält skapas mellan fyrdubbelstavarna genom att använda alternerande RF- och LIKSTRÖMSspänningar. Jonens bana inuti fyrdubbla påverkas av närvaron av samma spänningar över motsatta stavar. Genom att applicera RF på likströmsspänning kan jonens bana stabiliseras. Det är denna egenskap hos fyrdubbla som gör att den kan användas som ett massfilter som selektivt kan låta specifika joner passera igenom. Beroende på behovet kan en fyrdubbel manövreras i antingen statiskt läge eller skanningsläge. Det statiska läget tillåter endast joner med en angiven m/z att passera genom, vilket gör läget mycket selektivt och specifikt för jonen av intresse. Skanningsläget å andra sidan tillåter joner över hela m/z-området att passera igenom. Tandem fyrdubbla masspektrometrar kan således fungera på 4 möjliga sätt: i) den första fyrdubbla som arbetar i statiskt läge medan den andra arbetar i skanningsläge; ii) Den första fyrdubbel som arbetar i skanningsläge medan den andra arbetar i statiskt läge. iii) Båda fyrlingarna i skanningsläge. och iv) båda fyrlingarna i statiskt läge3. I ett typiskt MRM-experiment arbetar båda fyrdubbelerna i statiskt läge så att specifika prekursorer och deras resulterande produkter efter fragmentering kan övervakas. Detta gör tekniken mycket känslig och selektiv och möjliggör noggrann kvantifiering.
För molekylärbiologer är den mänskliga hjärnvävnaden och dess celler en skattkista. Dessa anmärkningsvärda enheter av ett ständigt intressant organ i människokroppen kan ge molekylära och cellulära insikter om dess funktion. Proteomiska undersökningar av hjärnvävnaden kan inte bara hjälpa oss att förstå den systemiska funktionen hos en frisk hjärna utan också de cellulära vägarna som blir dysregulerade när de orsakas av någon sjukdom4. Hjärnvävnaden med all sin heterogenitet är dock ett mycket komplext organ att analysera och kräver ett samordnat tillvägagångssätt för en bättre förståelse av förändringarna på molekylär nivå. Följande arbete beskriver hela arbetsflödet som börjar direkt från att extrahera proteiner från hjärnvävnad, skapa och optimera metoderna för MRM-analys till validering av målen (figur 1). Här har vi systematiskt lyft fram de viktigaste stegen i ett framgångsrikt MRM-baserat experiment med hjälp av mänsklig hjärnvävnad i syfte att introducera tekniken och dess utmaningar för ett bredare forskarsamhälle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tekniker som Immunohistochemistry och Western blotting ansågs vara guldstandarderna för validering av proteinmål i många år. Dessa metoder använder sig än i dag av smärre ändringar i protokollet och litet beroende av teknik, vilket gör dem mycket besvärliga och tråkiga. Utöver detta innebär de också användning av dyra antikroppar som inte alltid visar samma specificitet över partier och kräver en hel del expertis. Dessutom har endast en liten del av proteiner som identifieras med hjälp av tekniker med…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB till SS och MASSFIITB Facility vid IIT Bombay med stöd av institutionen för bioteknik (BT/PR13114/INF/22/206/2015) för att utföra alla MS-relaterade experiment.
Vi vill särskilt tacka Rishabh Yadav för att han gjorde och redigerade hela videon och Mr. Nishant Nerurkar för hans arbete med att redigera ljudet.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referências
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Bioquímica. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
