In vitro vurdering af myokardie beskyttelse efter hypotermi-forkonditionering i en human hjerte myocytter model

Summary

De forskellige virkninger af forskellige grader af hypotermi på myokardiebeskyttelse er ikke blevet grundigt evalueret. Formålet med denne undersøgelse var at kvantificere niveauet af celledød efter forskellige hypotermibehandlinger i en human kardiomyocytbaseret model, hvilket lagde grunden til fremtidig dybdegående molekylær forskning.

Abstract

Iskæmi /reperfusion-afledt myokardie dysfunktion er et almindeligt klinisk scenarie hos patienter efter hjertekirurgi. Især følsomheden af kardiomyocytter til iskæmisk skade er højere end for andre cellepopulationer. På nuværende tidspunkt giver hypotermi betydelig beskyttelse mod en forventet iskæmisk fornærmelse. Undersøgelser af komplekse hypotermi-inducerede molekylære ændringer er dog fortsat begrænsede. Derfor er det vigtigt at identificere en kulturtilstand svarende til in vivo-forhold, der kan fremkalde skader svarende til den, der observeres i den kliniske tilstand, på en reproducerbar måde. For at efterligne iskæmilignende tilstande in vitro blev cellerne i disse modeller behandlet med ilt/ glukosemangel (OGD). Derudover anvendte vi en standardtidstemperaturprotokol, der blev brugt under hjertekirurgi. Desuden foreslår vi en tilgang til at anvende en enkel, men omfattende metode til kvantitativ analyse af myokardieskader. Apoptose og ekspressionsniveauer for apoptoserelaterede proteiner blev vurderet ved flowcytometri og ved hjælp af et ELISA-kit. I denne model testede vi en hypotese om virkningerne af forskellige temperaturforhold på kardiomyocytapoptose in vitro. Pålideligheden af denne model afhænger af streng temperaturkontrol, kontrollerbare eksperimentelle procedurer og stabile eksperimentelle resultater. Derudover kan denne model bruges til at studere den molekylære mekanisme af hypotermisk kardibeskyttelse, hvilket kan have vigtige konsekvenser for udviklingen af komplementære terapier til brug med hypotermi.

Introduction

Iskæmi/reperfusion-afledt myokardie dysfunktion er et almindeligt klinisk scenarie hos patienter efter hjertekirurgi^1,2. Under nonpulsatile lav flow perfusion og perioder med total kredsløbsstop, skader, der involverer alle typer af hjerteceller stadig opstår. Især følsomheden af kardiomyocytter til iskæmisk skade er højere end for andre cellepopulationer. På nuværende tidspunkt giver terapeutisk hypotermi (TH) betydelig beskyttelse mod en forventet iskæmisk fornærmelse hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi^3,4. TH defineres som en kernetemperatur på 14-34 °C, selv om der ikke er enighed om en definition af køling under hjertekirurgi^5,6,7. I 2013 foreslog et internationalt ekspertpanel et standardiseret rapporteringssystem til klassificering af forskellige temperaturområder af systemisk hypotermisk kredsløbsstop⁸. Baseret på elektroencefalografi og metabolismeundersøgelser af hjernen delte de hypotermi i fire niveauer: dyb hypotermi (≤ 14 °C), dyb hypotermi (14,1-20 °C), moderat hypotermi (20,1-28 °C) og mild hypotermi (28,1-34 °C). Ekspertkonsensussen gav en klar og ensartet klassificering, der gjorde det muligt for undersøgelser at være mere sammenlignelige og give mere klinisk relevante resultater. Denne beskyttelse, som TH yder , er baseret på dens evne til at reducere cellernes metaboliske aktivitet og yderligere begrænse deres højenergifosfatforbrug^9,10. Men den rolle, TH i myokardie beskyttelse er kontroversiel og kan have flere virkninger afhængigt af graden af hypotermi.

Myokardie I/R er velkendt for at være ledsaget af øget celleapoptise¹¹. Nylige rapporter har observeret, at programmeret kardiomyocytdød stiger under åben hjertekirurgi og kan falde sammen med nekrose og derved øge antallet af døde myokardieceller¹². Derfor er reduktion af kardiomyocytapoptose en nyttig terapeutisk tilgang i klinisk praksis. I mus atrie HL-1 kardiomyocyt model, terapeutisk hypotermi blev vist sig at reducere mitokondrie frigivelse af cytochrom c og apoptose-inducerende faktor (AIF) under reperfusion¹³. Men effekten af temperatur i reguleringen af apoptose er kontroversiel og synes at afhænge af graden af hypotermi. Cooper og kolleger bemærkede, at sammenlignet med en normoterm kardiopulmonisk bypass kontrolgruppe blev apoptosehastigheden af myokardievæv fra svin med den dybe hypotermiske kredsløbsstop øget¹⁴. Derudover har resultaterne af nogle undersøgelser antydet, at dyb hypotermi kan aktivere apoptosevejen, mens mindre aggressiv hypotermi ser ud til at hæmme vejen^12,15,16. Årsagen til dette resultat kan skyldes forvirrende virkninger forbundet med iskæmisk skade og manglende forståelse af de mekanismer, hvormed temperaturen påvirker myokardievæv. Derfor bør de temperaturgrænser, hvor apoptose forbedres eller dæmpes, defineres nøjagtigt.

For at få en bedre forståelse af de mekanismer, der er forbundet med hypotermiens effektivitet og give et rationelt grundlag for dens gennemførelse hos mennesker, er det vigtigt at identificere en kulturtilstand svarende til in vivo-tilstande, der kan producere skader svarende til den, der observeres for den kliniske tilstand på en reproducerbar måde. Et vigtigt skridt i retning af at nå dette mål er at etablere de optimale betingelser for at fremkalde kardiomyocytapoptose. Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse de metodologiske detaljer om ilt-glukosemangelforsøg med dyrkede celler, en let in vitro-model af iskæmi-reperfusion. Desuden vurderede vi effekten af forskellige hypoxic-iskæmiske tider på kardiomyocytapoptose, og verificerede vores hypotese om effekten af forskellige temperaturforhold på celleapoptose in vitro.

Protocol

Oplysninger om handelsreagenser og -instrumenter er anført i materialeoversigten. Ac16 menneskelige kardiomyocyt celle linje blev afledt af sammensmeltningen af primære celler fra voksne ventrikulær hjertevæv med SV40-transformerede menneskelige fibroblaster17, som blev købt fra BLUEFBIO (Shanghai, Kina). Cellelinjen udvikler mange biokemiske og morfologiske træk, der er karakteristiske for kardiomyocytter. Derudover er cellelinjen meget udbredt t…

Representative Results

Virkningen af OGD-eksponering på HCMs levedygtighed blev bestemt af CCK-8-analysen. Sammenlignet med den, der blev observeret i kontrolgruppen, blev celledygtigheden væsentligt reduceret på en tidsafhængig måde (figur 2A). Apoptoseraterne for HCMs på forskellige tidspunkter efter reperfusion viste en specifik tendens, hvor apoptoseraterne fra 0 til 16 timer gradvist steg og nåede maksimalsatsen ved 16 timer tidspunktet (Figur 2B). Som OGD for 12 timer red…

Discussion

Kompleksiteten af intakte dyr, herunder samspillet mellem forskellige typer celler, forhindrer ofte detaljerede undersøgelser af specifikke komponenter af I/R-skade. Derfor er det nødvendigt at etablere en in vitro cellemodel, der nøjagtigt kan afspejle de molekylære ændringer efter iskæmi in vivo. Forskning i OGD-modeller er tidligere blevet rapporteret^13,22, og mange avancerede metoder er blevet etableret^23,<sup class="x…

Materials

Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056