In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel
Summary
De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.
Abstract
Ischemie/reperfusie-afgeleide myocarddisfunctie is een veel voorkomend klinisch scenario bij patiënten na een hartoperatie. Met name de gevoeligheid van cardiomyocyten voor ischemisch letsel is hoger dan die van andere celpopulaties. Op dit moment biedt onderkoeling een aanzienlijke bescherming tegen een verwachte ischemische belediging. Het onderzoek naar complexe door onderkoeling veroorzaakte moleculaire veranderingen blijft echter beperkt. Daarom is het essentieel om een kweektoestand te identificeren die vergelijkbaar is met in vivo omstandigheden en die schade kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die waargenomen in de klinische toestand op een reproduceerbare manier. Om ischemie-achtige aandoeningen in vitro na te bootsen, werden de cellen in deze modellen behandeld met zuurstof/glucosedeprivatie (OGD). Daarnaast hebben we een standaard tijd-temperatuurprotocol toegepast dat wordt gebruikt tijdens hartchirurgie. Verder stellen wij een aanpak voor om een eenvoudige maar alomvattende methode te gebruiken voor de kwantitatieve analyse van myocardletsel. Apoptose en expressieniveaus van apoptose-geassocieerde eiwitten werden beoordeeld door flowcytometrie en met behulp van een ELISA-kit. In dit model hebben we een hypothese getest met betrekking tot de effecten van verschillende temperatuuromstandigheden op cardiomyocyt apoptose in vitro. De betrouwbaarheid van dit model hangt af van strikte temperatuurregeling, controleerbare experimentele procedures en stabiele experimentele resultaten. Bovendien kan dit model worden gebruikt om het moleculaire mechanisme van hypothermische cardioprotectie te bestuderen, wat belangrijke implicaties kan hebben voor de ontwikkeling van complementaire therapieën voor gebruik met hypothermie.
Introduction
Ischemie/reperfusie-afgeleide myocarddisfunctie is een veel voorkomend klinisch scenario bij patiënten na hartchirurgie1,2. Tijdens niet-pulserende lage stroomperfusie en perioden van totale bloedsomloopstilstand treedt nog steeds schade op waarbij alle soorten hartcellen betrokken zijn. Met name de gevoeligheid van cardiomyocyten voor ischemisch letsel is hoger dan die van andere celpopulaties. Op dit moment biedt therapeutische hypothermie (TH) een aanzienlijke bescherming tegen een verwachte ischemische belediging bij patiënten die een hartoperatie ondergaan3,4. TH wordt gedefinieerd als een kernlichaamstemperatuur van 14-34 °C , hoewel er geen consensus bestaat over een definitie van koeling tijdens hartchirurgie5,6,7. In 2013 stelde een internationaal panel van deskundigen een gestandaardiseerd rapportagesysteem voor om verschillende temperatuurbereiken van systemische hypothermische bloedsomloopstilstand te classificeren8. Op basis van elektro-encefalografie en metabolismestudies van de hersenen verdeelden ze hypothermie in vier niveaus: diepe onderkoeling (≤ 14 °C), diepe onderkoeling (14,1-20 °C), matige onderkoeling (20,1-28 °C) en milde hypothermie (28,1-34 °C). De consensus van deskundigen zorgde voor een duidelijke en uniforme classificatie, waardoor studies beter vergelijkbaar konden zijn en meer klinisch relevante resultaten konden opleveren. Deze door TH geboden bescherming is gebaseerd op haar vermogen om de metabolische activiteit van cellen te verminderen, waardoor hun hoge-energetische fosfatenverbruik verder wordt beperkt9,10. De rol van TH in myocardbescherming is echter controversieel en kan meerdere effecten hebben, afhankelijk van de mate van onderkoeling.
Myocard I/R staat erom bekend dat het gepaard gaat met verhoogde cel apoptisis11. Recente rapporten hebben waargenomen dat geprogrammeerde cardiomyocytdood toeneemt tijdens openhartchirurgie en kan samenvallen met necrose, waardoor het aantal dode myocardcellentoeneemt 12. Daarom is het verminderen van cardiomyocyt apoptose een nuttige therapeutische benadering in de klinische praktijk. In het muisatriale HL-1 cardiomyocytmodel werd aangetoond dat therapeutische hypothermie de mitochondriale afgifte van cytochroom c en apoptose-inducerende factor (AIF) tijdens reperfusie13vermindert. Het effect van temperatuur bij het reguleren van apoptose is echter controversieel en lijkt afhankelijk te zijn van de mate van onderkoeling. Cooper en collega’s merkten op dat in vergelijking met een normothermische cardiopulmonale bypass-controlegroep, de apoptosesnelheid van myocardweefsel van varkens met de diepe onderkoelde bloedsomloopstilstand werd verhoogdmet 14. Bovendien hebben de resultaten van sommige studies gesuggereerd dat diepe onderkoeling de apoptoseroute kan activeren, terwijl minder agressieve onderkoeling de route12,15,16lijkt te remmen . De reden voor dit resultaat kan te wijten zijn aan verstorende effecten geassocieerd met ischemisch letsel en een gebrek aan begrip van de mechanismen waarmee temperatuur myocardweefsel beïnvloedt. Daarom moeten de temperatuurgrenzen waarmee apoptose wordt versterkt of verzwakt nauwkeurig worden gedefinieerd.
Om een beter begrip te krijgen van de mechanismen die verband houden met de werkzaamheid van onderkoeling en een rationele basis te bieden voor de implementatie ervan bij de mens, is het essentieel om een cultuurtoestand te identificeren die vergelijkbaar is met in vivo omstandigheden die schade kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die waargenomen voor de klinische aandoening op een reproduceerbare manier. Een essentiële stap in de richting van het bereiken van dit doel is het vaststellen van de optimale omstandigheden voor het induceren van cardiomyocyt apoptose. Dienovereenkomstig onderzochten we in deze studie de methodologische details met betrekking tot zuurstof-glucose deprivatie-experimenten met gekweekte cellen, een facile in vitro model van ischemie-reperfusie. Verder evalueerden we het effect van verschillende hypoxisch-ischemische tijden op cardiomyocyt apoptose, en verifieerden we onze hypothese met betrekking tot het effect van verschillende temperatuuromstandigheden op celapoptose in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De complexiteit van intacte dieren, met inbegrip van de interacties tussen verschillende soorten cellen, verhinderen vaak gedetailleerde studies van specifieke componenten van I/R-letsel. Daarom is het noodzakelijk om een in vitro celmodel vast te stellen dat de moleculaire veranderingen na ischemie in vivo nauwkeurig kan weergeven. Onderzoek naar OGD-modellen is eerder gerapporteerd13,22, en vele geavanceerde methoden zijn vastgesteld23<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), de China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); en het National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
Referências
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neurociência. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
