In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell
Summary
Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.
Abstract
Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach einer Herzoperation. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet Unterkühlung erheblichen Schutz vor einer erwarteten ischämischen Beleidigung. Untersuchungen zu komplexen Hypothermie-induzierten molekularen Veränderungen halten sich jedoch in Grenzen. Daher ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die schäden ähnlich denen im klinischen Zustand in einer reproduzierbaren Weise verursachen können. Um Ischämie-ähnliche Bedingungen in vitro nachzuahmen, wurden die Zellen in diesen Modellen durch Sauerstoff-/Glukoseentzug (OGD) behandelt. Darüber hinaus haben wir ein Standard-Zeittemperaturprotokoll angewendet, das während der Herzchirurgie verwendet wird. Darüber hinaus schlagen wir einen Ansatz vor, um eine einfache, aber umfassende Methode für die quantitative Analyse von Myokardverletzungen zu verwenden. Apoptose und Expressionsniveaus von Apoptose-assoziierten Proteinen wurden durch Durchflusszytometrie und mit einem ELISA-Kit bewertet. In diesem Modell haben wir eine Hypothese über die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Kardiomyozytenapoptose in vitro getestet. Die Zuverlässigkeit dieses Modells hängt von einer strengen Temperaturregelung, kontrollierbaren experimentellen Verfahren und stabilen experimentellen Ergebnissen ab. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um den molekularen Mechanismus des hypothermischen Kardioschutzes zu untersuchen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von ergänzenden Therapien zur Verwendung mit Hypothermie haben kann.
Introduction
Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach Herzoperationen1,2. Während der nichtpulsatilen Durchflussdurchblutung und Perioden des gesamten Kreislaufstillstands treten immer noch Schäden bei allen Arten von Herzzellen auf. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet die therapeutische Unterkühlung (TH) einen erheblichen Schutz gegen eine erwartete ischämische Beleidigung bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen3,4. TH ist definiert als eine Kernkörpertemperatur von 14-34 °C, obwohl es keinen Konsens über eine Definition der Kühlung während der Herzchirurgie5,6,7gibt. Im Jahr 2013 schlug eine internationale Expertengruppe ein standardisiertes Meldesystem vor, um verschiedene Temperaturbereiche des systemischen hypothermischen Kreislaufstillstands8zu klassifizieren. Basierend auf Elektroenzephalographie- und Stoffwechselstudien des Gehirns teilten sie die Hypothermie in vier Ebenen auf: tiefe Hypothermie (≤ 14 °C), tiefe Hypothermie (14,1-20 °C), moderate Unterkühlung (20,1-28 °C) und leichte Hypothermie (28,1-34 °C). Der Expertenkonsens bot eine klare und einheitliche Klassifizierung, die es ermöglicht, dass Studien vergleichbarer sind und klinisch relevantere Ergebnisse liefern. Dieser Schutz durch TH basiert auf seiner Fähigkeit, die metabolische Aktivität von Zellen zu reduzieren, was ihre Rate des verbrauchshöchstenergetischen Phosphatverbrauchs weiter begrenzt9,10. Jedoch, die Rolle der TH im Myokardschutz ist umstritten und kann mehrere Auswirkungen haben, je nach Grad der Unterkühlung.
Myokardi/R ist bekannt, dass sie von erhöhter Zellapoptisis11begleitet wird. Jüngste Berichte haben beobachtet, dass programmierte KardiomyozytenTod steigt während der Operation am offenen Herzen, und kann mit Nekrose zusammenfallen, wodurch die Zahl der toten Myokardzellen12erhöht. Daher ist die Verringerung der Kardiomyozytenapoptose ein nützlicher therapeutischer Ansatz in der klinischen Praxis. Im Maus-Atrial-HL-1-Kardiomyozytenmodell wurde gezeigt, dass die therapeutische Hypothermie die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c und Apoptose-induzierendem Faktor (AIF) während der Reperfusion13reduziert. Jedoch, die Wirkung der Temperatur bei der Regulierung der Apoptose ist umstritten und scheint vom Grad der Unterkühlung abhängen. Cooper und Kollegen beobachteten, dass im Vergleich zu einer normothermen kardiopulmonalen Bypass-Kontrollgruppe die Apoptoserate des Myokardgewebes von Schweinen mit dem tiefen hypothermen Kreislaufstillstandum 14erhöht wurde. Darüber hinaus haben die Ergebnisse einiger Studien darauf hindeutet, dass tiefe Hypothermie den Apoptose-Weg aktivieren kann, während weniger aggressive Hypothermie den Weg zu hemmen scheint12,15,16. Der Grund für dieses Ergebnis kann auf verwirrende Effekte im Zusammenhang mit ischämischen Verletzungen und ein Mangelndes Verständnis der Mechanismen, durch die Temperatur wirkt sich auf Myokardgewebe. Daher sollten die Temperaturgrenzwerte, bei denen die Apoptose erhöht oder abgeschwächt wird, genau definiert werden.
Um ein besseres Verständnis der Mechanismen zu gewinnen, die mit der Wirksamkeit der Hypothermie verbunden sind, und eine rationale Grundlage für ihre Umsetzung beim Menschen zu schaffen, ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die Schäden ähnlich denen für den klinischen Zustand in reproduzierbarer Weise verursachen können. Ein wesentlicher Schritt zur Erreichung dieses Ziels ist die Schaffung der optimalen Bedingungen für die Induktion von Kardiomyozyten-Apoptose. Dementsprechend untersuchten wir in der vorliegenden Studie die methodischen Details zu Sauerstoff-Glukose-Entzugsexperimenten mit kultivierten Zellen, einem einfachen In-vitro-Modell der Ischämie-Reperfusion. Darüber hinaus haben wir die Wirkung verschiedener hypoxisch-ischämischer Zeiten auf die Kardiomyozytenapoptose bewertet und unsere Hypothese über die Wirkung unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Zellapoptose in vitro überprüft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Komplexität intakter Tiere, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, verhindert häufig detaillierte Untersuchungen spezifischer Komponenten von I/R-Verletzungen. Daher ist es notwendig, ein In-vitro-Zellmodell zu etablieren, das die molekularen Veränderungen nach Ischämie in vivo genau reflektieren kann. Forschung an OGD-Modelle wurde bereits berichtet13,22, und viele ausgeklügelte Methoden wurden etabliert…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), der China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904) finanziert. und das National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
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