Valutazione in vitro della protezione del miocardio a seguito dell'ipotermia-precondizione in un modello di miociti cardiaci umani
Summary
Gli effetti distinti dei diversi gradi di ipotermia sulla protezione del miocardio non sono stati valutati a fondo. L’obiettivo del presente studio era quantificare i livelli di morte cellulare a seguito di diversi trattamenti di ipotermia in un modello umano a base di cardiomiociti, gettando le basi per una futura ricerca molecolare approfondita.
Abstract
La disfunzione miocardica derivata da ischemia/riperfusione è uno scenario clinico comune nei pazienti dopo la cardiochirurga. In particolare, la sensibilità dei cardiomiociti alle lesioni ischemiche è superiore a quella di altre popolazioni cellulari. Attualmente, l’ipotermia offre una notevole protezione contro un atteso insulto ischemico. Tuttavia, le indagini sui complessi cambiamenti molecolari indotti dall’ipotermia rimangono limitate. Pertanto, è essenziale identificare una condizione di coltura simile a condizioni in vivo che possono indurre danni simili a quello osservato nella condizione clinica in modo riproducibile. Per imitare le condizioni simili all’ischemia in vitro, le cellule in questi modelli sono state trattate con privazione di ossigeno / glucosio (OGD). Inoltre, abbiamo applicato un protocollo standard di temperatura del tempo utilizzato durante la cardiochirururga. Inoltre, proponiamo un approccio per utilizzare un metodo semplice ma completo per l’analisi quantitativa delle lesioni del miocardio. L’apoptosi e i livelli di espressione delle proteine associate all’apoptosi sono stati valutati dalla citometria del flusso e utilizzando un kit ELISA. In questo modello, abbiamo testato un’ipotesi riguardante gli effetti delle diverse condizioni di temperatura sull’apoptosi cardiomiocita in vitro. L’affidabilità di questo modello dipende da un rigoroso controllo della temperatura, procedure sperimentali controllabili e risultati sperimentali stabili. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare il meccanismo molecolare della cardioprotezione ipotermica, che può avere importanti implicazioni per lo sviluppo di terapie complementari per l’uso con ipotermia.
Introduction
La disfunzione miocardica derivata da ischemia/riperfusione è uno scenario clinico comune nei pazienti dopo la cardiochirurga1,2. Durante la perfusione non obbligatoria a basso flusso e i periodi di arresto circolatorio totale, si verificano ancora danni che coinvolgono tutti i tipi di cellule cardiache. In particolare, la sensibilità dei cardiomiociti alle lesioni ischemiche è superiore a quella di altre popolazioni cellulari. Attualmente, l’ipotermia terapeutica (TH) offre una protezione sostanziale contro un insulto ischemico previsto nei pazienti sottoposti a cardiochirurga3,4. Il TH è definito come una temperatura corporea interna di 14-34 °C, sebbene non esista consenso su una definizione di raffreddamento durante la cardiochirur5,6,7. Nel 2013, un gruppo internazionale di esperti ha proposto un sistema di segnalazione standardizzato per classificare vari intervalli di temperatura dell’arresto circolatorio ipotermicosistemico 8. Sulla base di studi di elettroencefalografia e metabolismo del cervello, hanno diviso l’ipotermia in quattro livelli: ipotermia profonda (≤ 14 °C), ipotermia profonda (14,1-20 °C), ipotermia moderata (20,1-28 °C) e ipotermia lieve (28,1-34 °C). Il consenso degli esperti ha fornito una classificazione chiara e uniforme, consentendo agli studi di essere più comparabili e fornire risultati più clinicamente rilevanti. Questa protezione offerta dalla TH si basa sulla sua capacità di ridurre l’attività metabolica delle cellule, limitando ulteriormente il loro tasso di consumo di fosfati ad altaenergia 9,10. Tuttavia, il ruolo della TH nella protezione del miocardio è controverso e può avere effetti multipli a seconda del grado di ipotermia.
L’I/R miocardico è noto per essere accompagnato da un aumento dell’apoptisicellulare 11. Recenti rapporti hanno osservato che la morte cardiomiocitaria programmata aumenta durante l’intervento a cuore aperto e può coincidere con la necrosi, aumentando così il numero di cellule miocardiche morte12. Pertanto, ridurre l’apoptosi cardiomiocita è un utile approccio terapeutico nella pratica clinica. Nel modello cardiomiocitario atriale del topo HL-1, è stata dimostrata che l’ipotermia terapeutica riduce il rilascio mitocondriale del citocromo c e del fattore che induce l’apoptosi (AIF) durante la riperfusione13. Tuttavia, l’effetto della temperatura nella regolazione dell’apoptosi è controverso e sembra dipendere dal grado di ipotermia. Cooper e colleghi hanno osservato che rispetto a un gruppo di controllo del bypass cardiopolmonare normotermico, il tasso di apoptosi del tessuto miocardico dei suini con l’arresto circolatorio ipotermico profondo è statoaumentato di 14. Inoltre, i risultati di alcuni studi hanno suggerito che l’ipotermia profonda può attivare la via dell’apoptosi, mentre l’ipotermia meno aggressiva sembrainibire la via 12,15,16. La ragione di questo risultato può essere dovuta a effetti confondenti associati a lesioni ischemiche e alla mancanza di comprensione dei meccanismi con cui la temperatura influisce sul tessuto miocardico. Pertanto, i limiti di temperatura ai quali l’apoptosi è migliorata o attenuata devono essere definiti con precisione.
Per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi associati all’efficacia dell’ipotermia e fornire una base razionale per la sua implementazione nell’uomo, è essenziale identificare una condizione di coltura simile a condizioni in vivo che possono produrre danni simili a quello osservato per la condizione clinica in modo riproducibile. Un passo essenziale verso il raggiungimento di questo obiettivo è stabilire le condizioni ottimali per indurre l’apoptosi cardiomiocitaria. Di conseguenza, nel presente studio, abbiamo esplorato i dettagli metodologici riguardanti gli esperimenti di privazione ossigeno-glucosio con cellule coltivate, un facile modello in vitro di ischemia-riperfusione. Inoltre, abbiamo valutato l’effetto di diversi tempi ipossico-ischemici sull’apoptosi cardiomiocitaria e verificato la nostra ipotesi riguardante l’effetto delle diverse condizioni di temperatura sull’apoptosi cellulare in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le complessità degli animali intatti, comprese le interazioni tra diversi tipi di cellule, spesso impediscono studi dettagliati su componenti specifici della lesione da I/R. Pertanto, è necessario stabilire un modello cellulare in vitro in grado di riflettere accuratamente i cambiamenti molecolari dopo l’ischemia in vivo. La ricerca sui modelli OGD è stataprecedentemente riportata 13,22e molti metodi sofisticati sono stati stabiliti23<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); e il National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
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