In vitro vurdering av myokardbeskyttelse etter hypotermi-prekondisjonering i en human hjerte-myocytter modell

Summary

De distinkte effektene av ulike grader av hypotermi på myokardbeskyttelse har ikke blitt grundig evaluert. Målet med den nåværende studien var å kvantifisere nivåene av celledød etter forskjellige hypotermibehandlinger i en human kardiomyocyttbasert modell, og legge grunnlaget for fremtidig grundig molekylær forskning.

Abstract

Iskemi/reperfusjons-avledet myokarddysfunksjon er et vanlig klinisk scenario hos pasienter etter hjertekirurgi. Spesielt er følsomheten til kardiomyocytter for iskemisk skade høyere enn for andre cellepopulasjoner. For tiden gir hypotermi betydelig beskyttelse mot en forventet iskemisk fornærmelse. Undersøkelser av komplekse hypotermiinduserte molekylære endringer er imidlertid fortsatt begrenset. Derfor er det viktig å identifisere en kulturtilstand som ligner på in vivo-forhold som kan indusere skade som ligner den som observeres i den kliniske tilstanden på en reproduserbar måte. For å etterligne iskemilignende tilstander in vitro, ble cellene i disse modellene behandlet av oksygen / glukosemangel (OGD). I tillegg brukte vi en standard tidstemperaturprotokoll som ble brukt under hjertekirurgi. Videre foreslår vi en tilnærming til å bruke en enkel, men omfattende metode for kvantitativ analyse av hjerteinfarktskade. Apoptose og uttrykksnivåer av apoptose-assosierte proteiner ble vurdert ved strømningscytometri og ved hjelp av et ELISA-sett. I denne modellen testet vi en hypotese om effekten av forskjellige temperaturforhold på kardiomyocytt apoptose in vitro. Påliteligheten til denne modellen avhenger av streng temperaturkontroll, kontrollerbare eksperimentelle prosedyrer og stabile eksperimentelle resultater. I tillegg kan denne modellen brukes til å studere den molekylære mekanismen for hypotermisk kardiobeskyttelse, noe som kan ha viktige implikasjoner for utviklingen av komplementære terapier for bruk med hypotermi.

Introduction

Iskemi/reperfusjons-avledet myokarddysfunksjon er et vanlig klinisk scenario hos pasienter etter hjertekirurgi^1,2. Under ikke-permanent lavstrømsperfusjon og perioder med total sirkulasjonsstans oppstår det fortsatt skader som involverer alle typer hjerteceller. Spesielt er følsomheten til kardiomyocytter for iskemisk skade høyere enn for andre cellepopulasjoner. For tiden gir terapeutisk hypotermi (TH) betydelig beskyttelse mot en forventet iskemisk fornærmelse hos pasienter som gjennomgår hjertekirurgi^3,4. TH er definert som en kjerne kroppstemperatur på 14-34 °C, selv om det ikke foreligger konsensus om en definisjon av kjøling under hjertekirurgi^5,6,7. I 2013 foreslo et internasjonalt ekspertpanel et standardisert rapporteringssystem for å klassifisere ulike temperaturområder for systemisk hypotermisk sirkulasjonsstans⁸. Basert på elektroencefalografi og metabolisme studier av hjernen, delte de hypotermi i fire nivåer: dyp hypotermi (≤ 14 °C), dyp hypotermi (14,1-20 °C), moderat hypotermi (20,1-28 °C) og mild hypotermi (28,1-34 °C). Ekspertkonsensus ga en klar og ensartet klassifisering, slik at studiene kunne være mer sammenlignbare og gi mer klinisk relevante resultater. Denne beskyttelsen gitt av TH er basert på dens evne til å redusere cellenes metabolske aktivitet, noe som ytterligere begrenser deres frekvens av høyenergifosfater forbruk^9,10. Imidlertid er TH-rollen i myokardbeskyttelse kontroversiell og kan ha flere effekter avhengig av graden av hypotermi.

Myokard I/R er kjent for å ledsages av økt celle apoptisis¹¹. Nylige rapporter har observert at programmert kardiomyocyttdød øker under åpen hjertekirurgi, og kan falle sammen med nekrose, og dermed øke antall døde myokardceller¹². Derfor er reduksjon av kardiomyocytt apoptose en nyttig terapeutisk tilnærming i klinisk praksis. I musen atrial HL-1 kardiomyocytt modell, terapeutisk hypotermi ble vist å redusere mitokondrie frigjøring av cytokrom c og apoptose-induserende faktor (AIF) under reperfusjon¹³. Effekten av temperatur i regulering av apoptose er imidlertid kontroversiell og ser ut til å avhenge av graden av hypotermi. Cooper og kolleger observerte at sammenlignet med en normotermisk kardiopulmonal bypass-kontrollgruppe, ble apoptosehastigheten av myokardvev fra griser med den dype hypotermiske sirkulasjonsstansen økt¹⁴. I tillegg har resultatene av noen studier antydet at dyp hypotermi kan aktivere apoptosebanen, mens mindre aggressiv hypotermi ser ut til å hemme banen^12,15,16. Årsaken til dette resultatet kan skyldes forvirrende effekter forbundet med iskemisk skade og mangel på forståelse av mekanismene ved hvilken temperatur påvirker myokardvev. Derfor bør temperaturgrensene der apoptose forbedres eller dempes, defineres nøyaktig.

For å få en bedre forståelse av mekanismene knyttet til effekten av hypotermi og gi et rasjonelt grunnlag for implementering hos mennesker, er det viktig å identifisere en kulturtilstand som ligner på in vivo-forhold som kan forårsake skade som ligner den som observeres for den kliniske tilstanden på en reproduserbar måte. Et viktig skritt mot å nå dette målet er å etablere de optimale forholdene for å indusere kardiomyocytt apoptose. Følgelig undersøkte vi i den nåværende studien de metodologiske detaljene om oksygenglukosemangelforsøk med dyrkede celler, en facile in vitro-modell av iskemi-reperfusjon. Videre evaluerte vi effekten av forskjellige hypoksiske-iskemiske tider på kardiomyocytt apoptose, og verifiserte vår hypotese om effekten av forskjellige temperaturforhold på celleapoptose in vitro.

Protocol

Informasjon om kommersielle reagenser og instrumenter er oppført i Materiallisten. AC16 human kardiomyocyttcellelinjen ble avledet fra sammensmelting av primære celler fra voksen ventrikulært hjertevev med SV40-transformerte menneskelige fibroblaster17, som ble kjøpt fra BLUEFBIO (Shanghai, Kina). Cellelinjen utvikler mange biokjemiske og morfologiske egenskaper som er karakteristiske for kardiomyocytter. I tillegg er cellelinjen mye brukt til å ev…

Representative Results

Effekten av OGD-eksponering på levedyktigheten til HCMer ble bestemt av CCK-8-analysen. Sammenlignet med det som ble observert i kontrollgruppen, ble celle levedyktigheten betydelig redusert på en tidsavhengig måte (figur 2A). Apoptosehastighetene til HCM-er på forskjellige tidspunkter etter reperfusjon viste en bestemt trend, hvor fra 0 til 16 h økte apoptosehastighetene gradvis og nådde maksimal hastighet ved 16-timers tidspunktet (Figur 2B). Som OGD for…

Discussion

Kompleksiteten til intakte dyr, inkludert samspillet mellom ulike typer celler, forhindrer ofte detaljerte studier av spesifikke komponenter av I / R-skade. Derfor er det nødvendig å etablere en in vitro-cellemodell som nøyaktig kan gjenspeile molekylære endringer etter iskemi in vivo. Forskning på OGD-modeller har tidligere blitt rapportert^13,22, og mange sofistikerte metoder er etablert^23,24. Forbe…

Materials

Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056