Avaliação in vitro da proteção do miocárdio após hipotermia-pré-condicionamento em um modelo de miócitos cardíacos humanos

Summary

Os efeitos distintos de diferentes graus de hipotermia na proteção do miocárdio não foram minuciosamente avaliados. O objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de morte celular após diferentes tratamentos de hipotermia em um modelo baseado em cardiomiócito humano, estabelecendo as bases para futuras pesquisas moleculares aprofundadas.

Abstract

A disfunção miocárdica derivada da isquemia/reperfusão é um cenário clínico comum em pacientes após cirurgia cardíaca. Em particular, a sensibilidade dos cardiomiócitos à lesão isquêmica é maior do que a de outras populações celulares. Atualmente, a hipotermia oferece proteção considerável contra um insulto isquêmico esperado. No entanto, as investigações sobre complexas alterações moleculares induzidas por hipotermia permanecem limitadas. Portanto, é essencial identificar uma condição de cultura semelhante às condições in vivo que possam induzir danos semelhantes aos observados na condição clínica de forma reprodutível. Para imitar condições semelhantes à isquemia in vitro, as células nesses modelos foram tratadas por privação de oxigênio/glicose (OGD). Além disso, aplicamos um protocolo padrão de temperatura de tempo usado durante a cirurgia cardíaca. Além disso, propomos uma abordagem para utilizar um método simples, mas abrangente, para a análise quantitativa da lesão do miocárdio. Os níveis de apoptose e expressão das proteínas associadas à apoptose foram avaliados por citometria de fluxo e utilizando um kit ELISA. Neste modelo, testamos uma hipótese sobre os efeitos de diferentes condições de temperatura na apoptose cardiomiócito in vitro. A confiabilidade deste modelo depende de rigoroso controle de temperatura, procedimentos experimentais controláveis e resultados experimentais estáveis. Além disso, este modelo pode ser usado para estudar o mecanismo molecular da cardioproteção hipotérmica, que pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de terapias complementares para uso com hipotermia.

Introduction

A disfunção miocárdica derivada da isquemia/reperfusão é um cenário clínico comum em pacientes após cirurgia cardíaca^1,2. Durante a perfusão de baixo fluxo não pulsatile e períodos de parada circulatória total, ainda ocorre danos envolvendo todos os tipos de células cardíacas. Em particular, a sensibilidade dos cardiomiócitos à lesão isquêmica é maior do que a de outras populações celulares. Atualmente, a hipotermia terapêutica (TH) oferece proteção substancial contra um insulto isquêmico esperado em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca^3,4. O TH é definido como uma temperatura corporal do núcleo de 14-34 °C, embora não exista consenso quanto a uma definição de resfriamento durante a cirurgia cardíaca^5,6,7. Em 2013, um painel internacional de especialistas propôs um sistema padronizado de relatórios para classificar várias faixas de temperatura de parada circulatória hipotérmica sistêmica⁸. Com base em estudos de eletroencefalografia e metabolismo do cérebro, eles dividiram a hipotermia em quatro níveis: hipotermia profunda (≤ 14 °C), hipotermia profunda (14,1-20 °C), hipotermia moderada (20,1-28 °C) e hipotermia leve (28,1-34 °C). O consenso dos especialistas proporcionou uma classificação clara e uniforme, permitindo que os estudos fossem mais comparáveis e proporcionassem resultados mais relevantes clinicamente. Esta proteção proporcionada pelo TH baseia-se em sua capacidade de reduzir a atividade metabólica das células, limitando ainda mais sua taxa de consumo de fosfatos de alta energia^9,10. No entanto, o papel do TH na proteção do miocárdio é controverso e pode ter múltiplos efeitos dependendo do grau de hipotermia.

A I/R miocárdio é bem conhecida por ser acompanhada pelo aumento da apoptise^{celular 11}. Relatórios recentes observaram que a morte programada por cardiomiócito aumenta durante a cirurgia de coração aberto, podendo coincidir com a necrose, aumentando assim o número de células miocárdia mortas¹². Portanto, reduzir a apoptose cardiomiócito é uma abordagem terapêutica útil na prática clínica. No modelo de cardiomiócito atrial hl-1 do camundongo, a hipotermia terapêutica foi demonstrada para reduzir a liberação mitocondrial do citocromo c e fator indutor de apoptose (AIF) durante a reperfusão¹³. No entanto, o efeito da temperatura na regulação da apoptose é controverso e parece depender do grau de hipotermia. Cooper e colegas observaram que, em comparação com um grupo de controle de bypass cardiopulmonar normoérmico, a taxa de apoptose do tecido miocárdio de suínos com a profunda parada circulatória hipotérmica foi aumentada¹⁴. Além disso, os resultados de alguns estudos sugerem que hipotermia profunda pode ativar a via da apoptose, enquanto hipotermia menos agressiva parece inibir a via^12,15,16. A razão para este resultado pode ser devido aos efeitos confusos associados à lesão isquêmica e à falta de compreensão dos mecanismos pelos quais a temperatura afeta o tecido miocárdio. Portanto, os limites de temperatura nos quais a apoptose é aprimorada ou atenuada devem ser definidos com precisão.

Para se ter uma melhor compreensão dos mecanismos associados à eficácia da hipotermia e fornecer uma base racional para sua implementação em humanos, é essencial identificar uma condição cultural semelhante às condições in vivo que possam produzir danos semelhantes aos observados para a condição clínica de forma reprodutível. Um passo essencial para alcançar esse objetivo é estabelecer as condições ideais para induzir a apoptose cardiomiocócica. Assim, no presente estudo, exploramos os detalhes metodológicos relativos aos experimentos de privação de oxigênio-glicose com células cultivadas, um modelo áxile in vitro de isquemia-reperfusão. Além disso, avaliamos o efeito de diferentes tempos hipoxicos-isquêmicos na apoptose cardiomiófica, e verificamos nossa hipótese quanto ao efeito de diferentes condições de temperatura na apoptose celular in vitro.

Protocol

As informações relativas aos reagentes e instrumentos comerciais estão listadas na Tabela de Materiais. A linha de células cardiomiócitos humanas AC16 foi derivada da fusão de células primárias do tecido cardíaco ventricular adulto com fibroblastos humanos transformados em SV4017,que foram comprados da BLUEFBIO (Xangai, China). A linha celular desenvolve muitas características bioquímicas e morfológicas características dos cardiomiócitos. …

Representative Results

O efeito da exposição ao OGD na viabilidade dos HCMs foi determinado pelo ensaio CCK-8. Em comparação com o observado no grupo controle, a viabilidade celular foi significativamente diminuída de forma dependente do tempo(Figura 2A). As taxas de apoptose de HCMs em diferentes horários após a reperfusão apresentaram tendência específica, onde de 0 a 16 h, as taxas de apoptose aumentaram gradualmente e atingiram a taxa máxima no ponto de tempo de 16h(Figura 2B).<…

Discussion

As complexidades dos animais intactos, incluindo as interações entre diferentes tipos de células, muitas vezes impedem estudos detalhados de componentes específicos da lesão de I/R. Portanto, é necessário estabelecer um modelo de célula in vitro que possa refletir com precisão as mudanças moleculares após a isquemia in vivo. Pesquisas sobre modelos OGD foram relatadas anteriormente^13,22, e muitos métodos sofisticados foram estabelecidos<sup class="xre…

Materials

Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056