In vitro Оценка защиты миокарда после гипотермии-предпосылок в модели миоцитов сердца человека
Summary
Различные последствия различных степеней гипотермии на защиту миокарда не были тщательно оценены. Целью настоящего исследования была количественная оценка уровней клеточной смертности после различных методов лечения гипотермии в модели на основе кардиомиоцитов человека, заложив основу для будущих углубленных молекулярных исследований.
Abstract
Ишемия / реперфузия полученных дисфункции миокарда является распространенным клиническим сценарием у пациентов после сердечной хирургии. В частности, чувствительность кардиомиоцитов к ишемической травме выше, чем у других популяций клеток. В настоящее время переохлаждение обеспечивает значительную защиту от ожидаемого ишемического оскорбления. Однако исследования сложных молекулярных изменений, вызванных переохлаждением, остаются ограниченными. Таким образом, важно определить состояние культуры, похожее на условия in vivo, которые могут вызвать ущерб, аналогичный тому, который наблюдается в клиническом состоянии в воспроизводимой манере. Для имитации ишемии, как условия in vitro, клетки в этих моделях были обработаны кислорода / глюкозы лишения (OGD). Кроме того, мы применили стандартный протокол температуры времени, используемый во время кардиохирургии. Кроме того, мы предлагаем подход к использованию простого, но всеобъемлющего метода количественного анализа травмы миокарда. Уровень апоптоза и экспрессии белков, связанных с апоптозом, оценивался по цитометрии потока и использованию комплекта ELISA. В этой модели мы протестировали гипотезу о влиянии различных температурных условий на кардиомиоцит апоптоз in vitro. Надежность этой модели зависит от строгого контроля температуры, контролируемых экспериментальных процедур и стабильных экспериментальных результатов. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения молекулярного механизма гипотермических кардиопротекторов, которые могут иметь важные последствия для развития дополнительных методов лечения для использования с переохлаждением.
Introduction
Ишемия / реперфузия полученных дисфункции миокарда является распространенным клиническим сценарием у пациентов послесердечной хирургии 1,2. Во время непульсатной перфузии низкого потока и периодов полного ареста кровообращения, повреждения, связанные со всеми типами клеток сердца все еще происходит. В частности, чувствительность кардиомиоцитов к ишемической травме выше, чем у других популяций клеток. В настоящее время терапевтическая гипотермия (TH) обеспечивает существенную защиту от ожидаемого ишемического оскорбления у пациентов, перенесшихоперацию на сердце 3,4. TH определяется как температура основного тела 14-34 градусов по Цельсию, хотя не существует консенсуса в отношении определения охлаждения во времясердечной хирургии 5,6,7. В 2013 году международная группа экспертов предложила стандартизированную систему отчетности для классификации различных температурных диапазонов системного гипотермии кровообращенияарест 8. Основываясь на электроэнцефалографии и метаболизме мозга, они разделили переохлаждение на четыре уровня: глубокое переохлаждение (≤ 14 градусов по Цельсию), глубокое переохлаждение (14,1-20 градусов по Цельсию), умеренное переохлаждение (20,1-28 градусов по Цельсию) и легкое переохлаждение (28,1-34 градусов по Цельсию). Консенсус экспертов обеспечил четкую и единую классификацию, что позволило бы исследованиям быть более сопоставимыми и обеспечить более клинически значимые результаты. Эта защита, предоставляемая TH, основана на его способности снижать метаболическую активность клеток, еще больше ограничивая их скорость потребления высокойэнергии фосфатов 9,10. Тем не менее, роль TH в защите миокарда является спорным и может иметь многочисленные последствия в зависимости от степени переохлаждения.
Миокарда I / R, как известно, сопровождается увеличением ячейки apoptisis11. Последние сообщения показали, что запрограммированная смерть кардиомиоцитов увеличивается во время операции на открытом сердце, и может совпадать с некрозом, тем самым увеличивая число мертвых клетокмиокарда 12. Таким образом, снижение кардиомиоцитов апоптоз является полезным терапевтическим подходом в клинической практике. В мышиных предсердий HL-1 кардиомиоцитов модели, терапевтическая гипотермия было показано, уменьшить митохондриальный релиз цитохрома c и апоптоз вызывающий фактор (AIF) во время reperfusion13. Тем не менее, влияние температуры в регулировании апоптоза является спорным и, как представляется, зависит от степени переохлаждения. Купер и его коллеги отметили, что по сравнению с нормотермической сердечно-легочной контрольной группой, апоптоз миокарда ткани свиней с глубоким переохлаждением кровообращения былувеличен на 14. Кроме того, результаты некоторых исследований показали, что глубокое переохлаждение может активировать апоптоз путь, в то время как менее агрессивные гипотермии, какпредставляется, подавляют путь 12,15,16. Причиной такого результата могут быть смешанные эффекты, связанные с ишемической травмой и непониманием механизмов, с помощью которых температура влияет на миокардную ткань. Таким образом, температурные пределы, при которых апоптоз усиливается или затухается, должны быть точно определены.
Чтобы лучше понять механизмы, связанные с эффективностью гипотермии и обеспечить рациональную основу для ее реализации в организме человека, важно определить культурное состояние, похожее на условия in vivo, которые могут привести к повреждению, аналогичному тому, которое наблюдается для клинического состояния в воспроизводимым образом. Важным шагом на пути к достижению этой цели является создание оптимальных условий для индуцирования кардиомиоцитов апоптоза. Соответственно, в настоящем исследовании мы исследовали методологические детали, касающиеся экспериментов по лишению кислорода-глюкозы культурных клеток, легкой в пробирке модели ишемии-реперфузии. Кроме того, мы оценили влияние различных гипоксико-ишемических времен на кардиомиоцит апоптоз и проверили нашу гипотезу о влиянии различных температурных условий на клеточный апоптоз в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сложности нетронутых животных, в том числе взаимодействия между различными типами клеток, часто препятствуют детальному изучению конкретных компонентов травмы I/R. Поэтому необходимо создать модель клеток in vitro, которая может точно отражать молекулярные изменения после ишемии in vivo. Ис?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (81970265, 81900281 81700288), Китайским постдокторантным научным фондом (2019M651904); и Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
Referências
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neurociência. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
