Bu çalışma, lazer ışınlanmış altın nanopartiküllerden tBLM’lere ısı transferinin dinamik, invaziv olmayan izlenmesini sağlamak için bir protokolü özetlemektedir. Sistem, tBLM’lerdeki iletkenlik değişikliklerinin gerçek zamanlı ölçümü için empedans spektroskopisini, ısı üretimi için altın nanopartikül aydınlatmasını yönlendiren yatay odaklı bir lazer ışını ile birleştirir.
Burada, altın elektrotlar üzerine monte edilmiş bağlı bilayer lipid membranları (tBLM’ ler) kullanılarak elektrokimya ile ışınlanmış altın nanopartiküller (GNP’ler) ve bilayer lipid membranları arasındaki ısı transferini araştırmak için bir protokol bildiriyoruz. Streptavidin konjuge GNP’ler gibi ışınlanmış modifiye EDILMIŞ GNP’ler, biotin gibi hedef molekülleri içeren tBLM’lere gömülür. Bu yaklaşım kullanılarak, ışınlanmış GNP’ler ile ilgi çekici varlıklara sahip model bilayer lipid membran arasındaki ısı transfer işlemleri yatay odaklı bir lazer ışını ile aracılık eder. Termal tahmine dayalı hesaplama modeli, tBLM’lerdeki elektrokimyasal olarak indüklenen iletim değişikliklerini doğrulamak için kullanılır. Kullanılan özel koşullar altında, ısı darbelerinin algılanarak altın nanopartiküllerin membran yüzeyine özel olarak bağlanması gerekirken, ilişkisiz altın nanopartiküller ölçülebilir bir yanıt veremedi. Bu teknik, lazer parametrelerinin, partikül boyutunun, parçacık kaplamalarının ve bileşimin optimizasyonuna izin veren termal tedaviler için stratejilerin tasarımı ve geliştirilmesi için doğrudan kullanılabilecek güçlü bir algılama biyosensörü olarak hizmet eder.
Işınlanmış altın nanomalzemelerin hipertermik performansı, enfeksiyonlar ve tümörler için minimal invaziv, seçici, hedefe yönelik yeni bir tedavi sınıfı sunar1. Bir lazer ile ısıtılabilen nanopartiküllerin istihdamı, hastalıklı hücreleri seçici olarak yok etmek ve seçici ilaç dağıtımı için bir araç sağlamak için kullanılmıştır2,3. Isıtılmış plazmonik nanopartiküllerin fototermoliz olgusunun bir sonucu hücre zarlarına zarar vermektir. Sıvı lipid bilayer membran, bu tür tedavilerden geçen hücreler için özellikle savunmasız bir bölge olarak kabul edilir, çünkü iç zar proteinlerinin deytürasyonu ve membran hasarı hücre ölümüne de yol açabilir4Hücre zarlarında iyonik potansiyel gradyanını korumak için birçok protein vardır. Nano ölçekte ısı transferini belirleme ve izleme yeteneği, ışınlanmış GNP’lerin1, 5,6,7,GNP’ler ve biyo-membranlar arasındaki moleküler etkileşimlerin değerlendirilmesi ve anlaşılmasının yanı sıra, gömülü GNP’lerin lazer kaynaklı ısıtma olaylarının biyolojik dokularda doğrudan sonuçlarının incelenmesi ve uygulanması için kilit öneme sahiptir, henüz tam olarakaydınlatılmamıştır 8. Bu nedenle, ışınlanmış GNP’lerin hipertermi sürecinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, hücrelerin doğal çevresini taklit eden bir nanomalzeme elektrot arayüzünün geliştirilmesi, biyolojik sistemler içindeki ışınlanmış altın nanopartiküllerin ısı transfer özelliklerinin derinlemesine araştırılması için bir araç sağlayabilir.
Yerel hücre zarlarının karmaşıklığı, hücrelerdeki ışınlanmış GNP etkileşimlerini anlamada önemli zorluklardan biridir. Doğal lipid membran mimarisinin ve işlevselliğinin yakın basit biyo-mimetik versiyonlarını sağlamak için geliştirilen çeşitli yapay membran platformları olmuştur, dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, siyah lipid membranlar9, desteklenen düzlemsel bilayer membranlar10,hibrid bilayer membranlar11,polimer yastıklı lipid bilayer membranlar12 ve bağlı bilayer lipid membranlar13. Her yapay lipid membran modeli, doğal lipid zarlarını taklit etme konusunda farklı avantajlara ve sınırlamalara sahiptir14.
Bu çalışmada, tBLM modelini kullanarak altın nanopartikül ve lipid membran etkileşimlerini değerlendirmek için bir sensör olarak lipid membran kaplı elektrotların istihdamı açıklanmaktadır. TBLM tabanlı biyosensör algılama şeması, bağlı membranların kendi kendini onarabildiği için doğal stabilite ve hassasiyet13 sağlar, diğer sistemlerin aksine (yama kelepçesi veya lipozomlar tarafından oluşturulan membranlar gibi) sadece az miktarda membran hasarı çökmelerine neden olur15,16,17,18. Ayrıca, tBLM’ler mm2 boyutlarında olduğundan, arka plan empedansı, nanopartikül etkileşimleri nedeniyle bazal membran iyonik akıdaki değişikliklerin kaydedilmesine olanak sağlayan yama kelepçesi kayıt tekniklerinden daha düşük büyüklükteki siparişlerdir. Bunun bir sonucu olarak, mevcut protokol, güçleri 135 nW / μm2kadar düşük lazerler tarafından heyecanlanan bağlı GNP’ler tarafından membran iletiminde yapılan değişiklikleri karşıtlayabilir.
Burada sunulan sistem, termal tedavilerin tasarlanması ve geliştirilmesi için gereken hassas lazer parametrelerinin, partikül boyutunun, partikül kaplamalarının ve bileşimin belirlenmesi için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Bu, ortaya çıkan fototermal tedavilerin iyileştirilmesi ve biyolojik sistemler içinde ayrıntılı ısı transferi mekanizmaları için değerli bilgiler sunmak için kritik öneme sahiptir. Sunulan protokol daha önce yayınlanan19. Protokolün ana hatları aşağıdaki gibidir: ilk bölüm tBLM oluşumunu tanımlar; ikinci bölümde kurulumun nasıl oluşturulanın ve heyecan lazer kaynağının nasıl hizalanması; son bölümde elektrik empedansı spektroskopisi verilerinden nasıl bilgi çıkarılacağı gösterilmektedir.
Bu protokol, altın nanopartiküllerin lazer ışınlanmasına yanıt olarak gerçek zamanlı elektrik empedansı kaydını sağlayan yatay lazer hizalama ile birlikte komanar elektrot substratlı tBLM modelinin kullanımını açıklar. Burada sunulan EIS kayıt yöntemi, membran boyunca iyon akım değişikliklerinin kaydedilmesini sağlamak için gerekli olan ve birleştirilmiş lazer ve altın nanopartikül etkileşiminin ürettiği ısıya karşılık gelen minimum bir deney listesi …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Keşif Programı (DP150101065) ve Düşük Seviyelerde (IDEAL) Son Kullanıcı Analizi için Entegre Cihaz için ARC Araştırma Merkezi (IH150100028) tarafından desteklendi.
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |