Medição do fluxo sanguíneo strial em Cochlea de rato utilizando uma janela de vaso aberto e microscopia de fluorescência intravital

Summary

Uma abordagem aberta da janela do vaso usando rastreadores fluorescentes fornece resolução suficiente para a medição do fluxo sanguíneo coclear (CoBF). O método facilita o estudo de mudanças estruturais e funcionais no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas.

Abstract

A transdução do som é metabolicamente exigente, e a função normal da microvasculatura na parede lateral é fundamental para manter o potencial endococlear, o transporte de íons e o equilíbrio de fluidos. Diferentes formas de distúrbios auditivos envolvem microcirculação anormal na cóclea. A investigação de como a patologia do fluxo sanguíneo coclear (CoBF) afeta a função auditiva é desafiadora devido à falta de métodos de interrogatório viáveis e à dificuldade de acesso ao ouvido interno. Uma janela de vaso aberto na parede coclear lateral, combinada com microscopia intravital de fluorescência, tem sido usada para estudar mudanças de CoBF in vivo, mas principalmente em cobaia e apenas recentemente no mouse. Este papel e o vídeo associado descrevem o método aberto da janela do vaso para visualizar o fluxo sanguíneo na cóclea do rato. Os detalhes incluem 1) preparação da suspensão de células sanguíneas rotuladas por fluorescentes em camundongos; 2) construção de uma janela de vaso aberta para microscopia intravital em um rato anestesiado, e 3) medição da velocidade e volume do fluxo sanguíneo usando uma gravação offline da imagem. O método é apresentado em formato de vídeo para mostrar como usar a abordagem da janela aberta no mouse para investigar alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear em condições normais e patológicas.

Introduction

A função normal da microcirculação na parede coclear lateral (compreendendo a maioria dos capilares no ligamento espiral e estria vascularis) é criticamente importante para a manutenção da função auditiva¹. CoBF anormal está implicado na fisiopatologia de muitos distúrbios do ouvido interno, incluindo perda auditiva induzida por ruído, hidrops de ouvido e presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9.

Protocol

NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência. Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oregon Health & Science University (número de aprovação da IACUC: TR01_IP00000968).

1. Preparação das células sanguíneas rotuladas por fluorescentes

1. Anestesiar os camundongos doadores (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de solução anestésico de cetamina/xilazina (5 mL/kg, consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Este protocolo de anestesia é muito confiável e mantém a pressão ar....

Results

Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral (Figura 1), a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por Dil em vasos rotulados pelo FITC-dextran era viável através de uma janela de vaso aberto. Figura 2A é uma imagem representativa tirada sob FIVM que mostra os capilares da parede lateral do ápice coclear do mouse. A lumina destes vasos é visíve.......

Discussion

Este artigo demonstra como os capilares na parede lateral coclear (e na estria vascularis) de um modelo de mouse podem ser visualizados com rotulagem fluorófora em uma preparação aberta de janela de vaso sob um sistema FIVM. O modelo de camundongos é amplamente utilizado e preferido como um modelo mamífero para investigar a saúde e a doença humana. O protocolo descrito aqui é uma abordagem viável para a imagem e investigação de CoBF na parede lateral do rato (particularmente na estria vascularis) usando uma janela de vas.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% de cloreto de sódio	Hospira	NDC 0409-1966-02	0,6 mL (para 1 mL)
1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato Sigma	Aldrich	468495	20 µ M
3,3′-Perclorato de dioctadeciloxacarbocianinaDio (3,3′-Perclorato de dioctadeciloxacarbocianina	Sigma Aldrich	D4292	20 µ Sistema de monitoramento M
CODA	scientific		CODA Monitor, para monitorar a pressão arterial e os batimentos cardíacos
Controlador	Fisher Scientific	12-542A
DC	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Medição do diâmetro do vaso
FITC-dextrano (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/ml
Injeção de Heparina Sódica, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 unidades USP/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (para 1 mL)
Objetiva de Microscópio	Mitutoyo	378-823-5	Modelo: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Câmera	Hamamatsu		Modelo: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluído para uso)	Lloyd	LPFL04821	0,2 mL (para 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Modelo: SZ61, microscópio fluorescente