Usando Y-Mazes fechados para avaliar o comportamento chemosensorial em répteis

Summary

Os labirintos Y permitem que os pesquisadores determinem a relevância de estímulos específicos que impulsionam o comportamento animal, especialmente pistas químicas isoladas de uma variedade de fontes. O design e o planejamento cuidadosos podem produzir dados robustos (por exemplo, discriminação, grau de exploração, inúmeros comportamentos). Este aparelho experimental pode fornecer uma visão poderosa das questões comportamentais e ecológicas.

Abstract

Os répteis utilizam uma variedade de pistas ambientais para informar e impulsionar o comportamento animal, como trilhas químicas de perfume produzidas por alimentos ou conespecíficos. Descriptografar o comportamento de vertebrados, particularmente espécies invasoras, permite a descoberta de pistas que induzem comportamento exploratório e podem ajudar no desenvolvimento de valiosas ferramentas biológicas básicas e aplicadas. No entanto, identificar comportamentos predominantemente impulsionados por pistas químicas versus outras pistas ambientais concorrentes pode ser desafiador. Labirintos Y são ferramentas comuns usadas em pesquisas de comportamento animal que permitem quantificação do comportamento quimioensorial vertebrado em uma faixa de taxa. Ao reduzir os estímulos externos, os labirintos Y removem fatores de confusão e apresentam animais focais com uma escolha binária. Em nossos estudos do labirinto Y, um animal perfumado é restrito a um braço do labirinto para deixar uma trilha de perfume e é removido uma vez que parâmetros de fixação de perfumes foram atingidos. Então, dependendo do tipo de ensaio, ou o animal focal é permitido no labirinto, ou uma trilha de perfume concorrente é criada. O resultado é um registro da escolha e comportamento do animal focal enquanto discrimina entre as pistas químicas apresentadas. Aqui, são descritos dois aparelhos Y-maze adaptados a diferentes espécies de répteis invasores: lagartos argentinos de tegu preto e branco(Salvator merianae) e pítons birmaneses (pythonbivittatus),delineando a operação e limpeza desses labirintos Y. Além disso, foram resumidas a variedade de dados produzidos, desvantagens experimentais e soluções e estruturas sugeridas de análise de dados.

Introduction

Labirintos Y são ferramentas comuns e simples em estudos de comportamento animal que permitem que uma variedade de perguntas sejam abordadas. Além de serem amplamente utilizados em estudos de laboratório, os labirintos Y também são funcionalmente compatíveis com vários ambientes de campo para estudar animais selvagens em ambientes relativamente remotos. Pesquisadores examinaram os comportamentos de vertebrados selvagens usando labirintos Y em uma grande variedade de taxas em aplicações de campo similarmente diversas (por exemplo, lampreys¹; peixe cíclico²; sapos venenosos³; lagartos lacertídeos⁴; cobras de liga⁵).

Muitos pesquisadores estão focados em como e em que grau as pistas químicas impulsionam comportamentos animais na ecologia reprodutiva, espacial e forrageira⁶. Uma variedade de estímulos químicos pode ser testada em labirintos Y e em escalas finas, como duas trilhas químicas que diferem ligeiramente na concentração⁷, ou capacidade de detecção com base no estado reprodutivo da^{espécie-alvo 8}. Trilhas químicas — o principal estímulo usado em testes de labirinto Y — podem ser naturalmente criadas por conespecíficos ou especificamente colocadas no ambiente por um pesquisador usando uma fonte química definida^1,5. Os estímulos também podem ser testados em combinações únicas para determinar a influência multimodal de pistas, como a mudança de contextos de apresentação de pistas (trilhas aéreas vs. substrato⁹; pistas visuais mais químicas^10). Embora existam muitos outros métodos para avaliar respostas quemosensoriais em répteis (ver seção de discussão), os labirintos Y permitem que os comportamentos de busca sejam avaliados e em múltiplas escalas temporais e espaciais, o que pode levar a maiores níveis de inferência comportamental.

Os répteis têm sido amplamente testados por sua dependência de pistas químicas na ecologia reprodutiva e forrageira, e os pesquisadores frequentemente empregam labirintos Y nestes estudos^11,12. A ecologia química dos répteis continua a ser decifrada por estudos que empregam labirintos Y para abordar uma variedade de questões evolutivas e comportamentais que são valiosas para os gestores da vida selvagem. Por exemplo, testes recentes com espécies invasivas de cobras e lagartos revelaram que apenas pistas químicas podem influenciar a escolha e a alocação de tempo dentro do novo ambiente de um labirinto Y^13,14,15.

O uso de grandes labirintos Y para animais focais de tamanho moderado (por exemplo, répteis de grande porte) é geralmente restrito a ambientes de laboratório onde os animais focais podem ser alojados facilmente a longo prazo, fatores experimentais (por exemplo, clima, luz, estímulos externos) podem ser controlados, e o acesso à infraestrutura (por exemplo, energia, água corrente) é ilimitado. Estudos sobre animais silvestres, no entanto, são muitas vezes restritos a locais específicos por várias razões (por exemplo, logística, permissão). Como resultado, surgem desafios que devem ser enfrentados por meio de resolução criativa de problemas e ajustes metodológicos para manter resultados consistentes e comparáveis.

Aqui, duas configurações experimentais foram descritas usando labirintos Y e ferramentas de monitoramento remoto para avaliar a ecologia química reprodutiva de répteis invasivos (ou seja, cobras e lagartos) em diferentes cenários de campo: lagartos de tegu argentinos capturados e cativos(Salvator merianae)em Gainesville, FL, e pítons birmaneses(Python bivittatus)em Everglades National Park, FL. Como implícito pelo seu nome, o aparelho Y-maze cria um ambiente experimental no qual um animal entra em uma passagem principal (a base do Y; "base") que, então, leva a duas passagens divergentes (os braços do Y; "braços"). Nestes experimentos, dois tipos de animais são usados para um único ensaio: animais que colocam o perfume (fornecem o cheiro de estímulo em uma área restrita do labirinto) e animais focais (dados são coletados neste animal enquanto explora a trilha do perfume).

Como um aparelho experimental em estudos quimiológicos, qualquer labirinto Y deve ser construído de forma a permitir a fácil remoção do animal dentro e pode ser dissecado para limpeza e reset completo. Também são discutidas as restrições inerentes a esses diferentes ambientes de teste (por exemplo, animais diurnos vs. noturnos, diferenças de infraestrutura) que provocaram ajustes metodológicos. Embora o foco estivesse nos lagartos tegu e nas pítons birmanesas, esses desenhos podem ser aplicados a uma ampla gama de espécies de répteis. Nesta pesquisa sobre répteis invasores, os labirintos Y beneficiam a taxa e a escala de inferência, pois permitem a rápida coleta de dados para informar as metas de manejo que mudam em passo com a ameaça de invasão representada por uma determinada espécie. Em particular, estudar a quimioterapia de espécies invasoras é fundamental para o desenvolvimento de ferramentas eficazes de controle químico.

A discriminação é a observação-chave dos testes empíricos usando labirintos Y onde um animal focal escolhe entre dois estímulos e que o processo de tomada de decisão é avaliado. Uma faixa de comportamentos também pode ser pontuada em ensaios Y-maze durante o próprio julgamento (ao vivo) ou após o julgamento (vídeo) para expandir o poder inferencial. A complexidade dos objetivos a priori de um determinado estudo ditam se a observação ao vivo ou gravações arquivadas melhor se adequam ao projeto. Aqui, os métodos do labirinto Y foram descritos em detalhes para abordar questões quimiológicas para informar estudos futuros de pesquisadores interessados em questões semelhantes sobre o comportamento dos répteis, especialmente na ecologia química.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo o uso de vertebrados vivos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Departamento de Agricultura dos EUA e pelo Serviço Geológico dos EUA.

NOTA: Como esses estudos se concentram em vertebrados invasivos, o cumprimento das normas de contenção também deve ser cumprido, o que impõe restrições específicas ao desenho e execução de experimentos. Embora muitos dos métodos sejam semelhantes entre os dois locais de estudo e o tempo de estudo diurno versus noturno, métodos distintos foram descritos em cada uma das duas seções seguintes.

1. Configuração do labirinto y e protocolo diurno para o Serviço de Inspeção de Saúde Vegetal Animal (APHIS) do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) Serviços de Saúde Vegetal Animal (APHIS) National Wildlife Services National Wildlife Research Center Florida Field Station: testes no local de tegus capturados e cativos

NOTA: Os planos para todos os componentes do labirinto Y e da estrutura de contenção são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

1. Dimensões e design do labirinto y
   1. Use uma peça inferior (painéis de revestimento de cimento de fibra de 1,22 m x 2,44 m) para ancorar o labirinto Y. Faça furos na camada superior para permitir que os parafusos de transporte passem para cima para a fixação das peças do labirinto. Para obter instruções específicas, consulte Arquivo Suplementar 1.
   2. Construir as paredes do labirinto a partir da placa branca de pvc; as dimensões internas da base são de 120 cm L (paredes laterais) x 42 cm W x 14 cm H.
      NOTA: A largura da passagem foi projetada para acomodar 2x largura focal animal. A largura extra permite a flexibilidade para que duas trilhas de perfume depositadas por animais sejam criadas.
   3. Certifique-se de que as dimensões internas dos braços são de 120 cm L (paredes laterais) x 40 cm W x 14 cm H.
   4. Monte o labirinto usando componentes inferiores, laterais e superiores separados protegidos antes de executar um teste. Faça o topo de acrílico claro para permitir a visualização de animais dentro do labirinto. Para obter instruções específicas, consulte Arquivo Suplementar 1.
      1. Quando uma única trilha de perfume é criada, use uma partição interna na base para restringir o acesso ao espaço para o tegu de fixação de perfume. Para obter instruções específicas, consulte Arquivo Suplementar 1.
      2. Quando duas trilhas de perfume são depositadas por animais diferentes em sequência, use um sistema de partições para bloquear braços alternados do labirinto e excluir cada animal de metades alternadas da base. Para obter instruções específicas, consulte Arquivo Suplementar 1.
   5. Use caixas para permitir o transporte e a coleta de animais usados em ensaios de labirinto Y. Certifique-se de que todas as caixas são opacas e equipadas com tampas removíveis e portas acrílicas que são facilmente protegidas.
      1. Certifique-se de que a caixa base (109 cm L x 56 cm W x 46 cm H) esteja na abertura da base do labirinto Y. Use-o para transferir animais perfumados ou focais para o labirinto e para aclimatação antes de abrir a porta e permitir o acesso voluntário dos animais ao labirinto.
      2. Certifique-se de que as caixas de braço (83 cm L x 50 cm W x 44 cm H) estão nas extremidades terminais dos braços do labirinto Y para facilitar a captura de animais perfumados ou focais.
      3. Para obter instruções específicas sobre construção e montagem, consulte Arquivo Suplementar 1.
2. Configuração da câmera para aquisição de vídeo diurno
   1. Especificações da câmera: Certifique-se de que as câmeras do projeto possam gravar vídeo contínuo em condições de luz variável e são adequadas para uso ao ar livre sob condições de temperatura e umidade predominantes.
      1. Com a câmera montada na parte inferior do gabinete de estudo, certifique-se de que todo o labirinto Y possa ser capturado no campo de visão da câmera. Ajuste a lente ou altura da câmera para aumentar ou diminuir o campo de visão. Quando o campo de visão estiver definido, certifique-se de que detalhes comportamentais suficientes, como movimentos de língua, possam ser capturados.
         NOTA: Se a altura do gabinete de estudo for fixada (por exemplo, 180 cm H) limitando assim os ajustes ao campo de visão, várias câmeras podem ser usadas para obter cobertura completa do interior do labirinto Y. Certifique-se de que as câmeras estão configurais para ativar "amplo alcance dinâmico" quando usado em aplicativos ao ar livre.
   2. Especificações de energia: Certifique-se de que cada câmera tenha uma fonte de alimentação adequada para gravar vídeo contínuo durante a duração do teste planejado (por exemplo, use um UPS (Uninterruptible Power Supply, fonte de alimentação ininterrupta) com uma bateria de backup incorporada para garantir a energia contínua).
      NOTA: Se não houver fonte de alimentação CA disponível, as câmeras POE (power over ethernet) podem ser alimentadas através de cabos de rede conectados a um gravador de vídeo digital (DVR) ou interruptor POE onde um gravador de vídeo de rede (NVR) é usado.
   3. Especificações de gravação: Ao escolher um DVR ou NVR, certifique-se de que ele atenda aos requisitos do projeto, incluindo capacidade de armazenamento suficiente e conectores POE suficientes (DVR) ou canais de câmera (NVR) para acomodar o número de câmeras usadas. Selecione parâmetros de gravação para se adequar à qualidade de vídeo desejada, mantendo em mente o tamanho dos arquivos de dados (por exemplo, taxa de compactação H264 e uma taxa de imagem de 10 quadros por segundo [FPS]).
   4. Protocolo para obtenção e processamento de vídeo:
      1. Comece a gravar o vídeo a partir do momento em que o animal começa a entrar no labirinto até o momento da captura ou prazo predefinido (1.3.3.4).
      2. Usando um software que pode ser instalado em um ou mais computadores e permite a visualização de vídeos ao vivo ou gravados, exporta arquivos usando o formato de vídeo de escolha.
      3. Certifique-se de exportar a mesma janela de tempo e duração do vídeo para cada câmera usada para permitir a revisão simultânea de vários feeds.
      4. Certifique-se de exportar os dados regularmente, pois muitos sistemas substituirão dados mais antigos com novos dados se a capacidade de armazenamento de arquivos DVR/NVR for limitada.
3. Protocolo para executar animais que colocam perfume
   1. Avaliação do viés
      1. Antes de executar testes experimentais, avalie um labirinto Y para viés montando o labirinto, como descrito abaixo, mas sem apresentar o perfume no papel. Aclimatar o animal focal, e começar o julgamento.
         NOTA: Dependendo do desenho do estudo (por exemplo, medidas repetidas usando os mesmos animais focais versus testes de novos animais focais cada vez), testes de viés estabelecerão que o labirinto em si, por design, não distorce a escolha de um animal focal. Muitos fatores contribuem para o viés como elevação, luz solar e marcadores visuais.
      2. Se reorientar ou ajustar outros aspectos físicos do labirinto não remover viés lateral, randomize o braço designado para receber um perfume experimental em um determinado ensaio.
         NOTA: Ao longo de um determinado número de ensaios, um labirinto imparcial resulta em uma probabilidade de escolha de 0,5 para cada braço, e um teste binomial é realizado(Figura 2).
   2. Preparação para o teste e montagem do labirinto Y
      1. Use luvas de nitrito por toda parte ao manusear quaisquer superfícies que o animal possa explorar para evitar a contaminação do perfume. Altere as luvas entre os ensaios e dentro da configuração de um teste se várias trilhas de perfume estão sendo criadas.
      2. Prepare papel de perfumamento novo e limpo (papel açougueiro branco, mínimo de 61 cm de largura) em uma superfície limpa. Corte até o comprimento apropriado para que o papel de cada seção possa se sobrepor na junção do Y e estender-se além das extremidades da base e dos braços para caber sob as caixas.
      3. Varrer a parte inferior do labirinto e, em seguida, cobrir com papel diretamente ou com uma camada de limite entre o papel e a parte inferior (por exemplo, folha de plástico) para facilitar a limpeza se o animal defecar ou almíscar no labirinto.
      4. Fixar o papel no lugar perfurando-o com parafusos de carruagem na parte inferior, trabalhando de uma extremidade para outra para manter a superfície lisa. Sobreponha os papéis na junção de tal forma que o papel base esteja em cima.
      5. Coloque as laterais do labirinto em posição sobre os parafusos de transporte, mas não os segure até o fundo.
      6. Insira e proteja as partições necessárias para que o tipo de ensaio seja testado (ver ensaios de aroma único 1.3.3 vs. duplo-perfume 1.3.4).
      7. Deslize as peças de cima acrílica em ranhuras e fixe com pregos de cabeça plana.
      8. Fixar os lados ao fundo apertando as porcas das asas nos parafusos de transporte.
      9. Coloque as caixas de braço limpas no lugar e fixe com parafusos de polegar. Fixar a tampa da caixa usando cabos. Certifique-se de que as portas foram removidas.
   3. Ensaios de perfume único
      NOTA: O objetivo desses ensaios é apresentar uma única trilha de perfume no labirinto Y que vai da base até um braço.
      1. Antes de encaixar a parte superior acrílica, fixe a partição para bloquear o braço não tratado. Selecione o braço perfumado aleatoriamente (por exemplo, lançamento de moeda, gerador de números aleatórios).
      2. Coloque o animal que coloca o perfume na caixa de base limpa e seca. Fixar a tampa da caixa base (por exemplo, laços de cabo, parafusos) e a porta (por exemplo, parafuso do polegar). Transporte a caixa de retenção para o gabinete de estudo e fixe-a até o final da base do labirinto Y com parafusos de polegar.
         NOTA: Certifique-se de que a porta da caixa base está no lugar antes de carregar o animal.
      3. Aclimatar o animal na caixa por um período conjunto e consistente (por exemplo, 60 min). Remova a porta da caixa base e permita que o animal entre livremente no labirinto.
      4. Monitore a atividade animal remotamente usando alimentação de vídeo (veja abaixo). Depois que o animal tiver viajado da caixa base para a caixa de braço, remova o animal do labirinto enquanto o aroma está completo.
         1. Se o animal estiver dentro de qualquer caixa, insira e proteja a porta removível, retire a caixa e devolva o animal ao seu recinto.
         2. Se o animal estiver de volta ao labirinto, espere perto do labirinto até que o animal seja visto voltando para a caixa, e então remova a caixa.
            NOTA: Os squamates defecam defensivamente e criam sinais de alarme que contaminam o cheiro que está sendo testado, então evitem assustar o animal.
         3. Se o animal não voltar para uma caixa, aproxime-se lentamente do labirinto e use pistas visuais (por exemplo, acenando lentamente) para incentivar o animal para dentro da caixa e, em seguida, remova a caixa.
      5. Limpe e seque a caixa base (1.5.5).
      6. Se ocorreu defecação, colete e absorva o máximo possível com uma toalha de papel, mas não limpe para evitar a propagação.
      7. Desmonte parcialmente o labirinto para permitir a remoção da partição interior e, em seguida, remonta. Limpe a partição (1.5.5).
      8. Prossiga para a seção 1.4 para o protocolo para a execução de animais focais.
   4. Ensaios de duplo perfume
      NOTA: O objetivo desses ensaios é apresentar duas trilhas de perfume diferentes simultaneamente no labirinto Y, com ambos correndo da base através de seu respectivo braço, escolhido aleatoriamente.
      1. Antes de encaixar a parte superior acrílica, segure as divisórias para bloquear o braço não escolhido para o primeiro cheiro e metade da base em frente ao braço bloqueado.
      2. Siga os procedimentos descritos acima para um único ensaio de odor (1.3.3 a 1.3.3.8) com uma exceção. Quando a porta acrílica for removida (1.3.3.3), insira uma porta de meio tamanho na abertura do lado que deve permanecer bloqueada para garantir que o animal perfumado só possa se mover na seção aberta do labirinto.
      3. Desmonte parcialmente o labirinto, remova as partições e limpe (1.5.5). Seque com toalhas limpas.
      4. Reinstale as partições, mas vire-as para bloquear a área agora perfumada do labirinto. Reinstale a parte superior acrílica.
      5. Repita o passo 1.3.4.2 para o segundo animal que pomente o perfume.
      6. Desmonte parcialmente o labirinto e remova as divisórias. Remonte o labirinto.
      7. Prossiga para a seção 1.4 para o protocolo para a execução de animais focais.
4. Protocolo para a execução de animais focais durante o horário diurno
   1. Siga os passos 1.3.3.2 a 1.3.3.3 com o animal focal planejado para esse teste.
   2. Monitore a atividade animal remotamente usando vídeo. Se observar sobre uma janela definida de tempo de exploração, inicie o temporizador quando o animal emergiu completamente da caixa base.
   3. Ao término do ensaio, remova o animal (1.3.3.4).
5. Colapso e limpeza
   1. Retire as caixas restantes do labirinto e desmonte todas as caixas. Use luvas de nitrito frescas durante toda a desmontagem e limpeza.
   2. Remova as peças de cima acrílicas e reserve-as em um local seguro para limpeza para evitar arranhões ou rachaduras. Certifique-se de evitar o arranhão de peças quando removido (o campo de visão claro para o comportamento de videomonitoramento deve ser mantido). Desmonte as laterais do labirinto e reserve-as para limpeza.
      NOTA: Minimize arranhões e degradação uv aos materiais do labirinto Y mantendo-os sempre sombreados.
   3. Remova o papel (e o plástico) em um movimento consistente, enrolando-o para evitar a contaminação do fundo e descartá-lo.
   4. Use um sabonete inodoro, de nível de laboratório e panos de esfoliação macia ou microfibra para limpar todas as superfícies das peças do labirinto Y e todas as caixas. Limpe as peças de topo acrílico e portas removíveis com o mesmo sabão, mas com panos macios de esponja ou microfibra para evitar arranhões.
      NOTA: Os sinais químicos conhecidos em répteis estêmicos são compostos solúveis em lipídios, e lavar com detergente é o protocolo padrão para limpar pistas lipídicas e outros aromas de aparelhos à base de polímero em estudos de vertebrados terrestres^11,12,21.
      NOTA: Nas aplicações de campo, podem ser necessários protocolos de saneamento. Se assim for, pulverize todas as superfícies internas do labirinto (piso, paredes, divisórias, peças acrílicas, caixas) com uma solução de saneamento adequada, deixe-o sentar por 10 minutos e, em seguida, limpe com um pano de microfibra.
   5. Enxágüe os componentes limpos com água limpando as superfícies com toalhas de microfibra limpas e molhadas e evite permitir que o resíduo de sabão seque antes de enxaguar; não despeje água no labirinto.
   6. Deixe as peças secarem ou sequem com panos de microfibra frescos.
   7. Uma vez seco, remonte as peças do labirinto se executar outro teste imediatamente.

2. Configuração do labirinto y e protocolo de cronometragem crepuscular para os testes do Serviço Geológico dos EUA (USGS) em colaboração com o National Park Service: testes relativamente remotos de pítons birmaneses capturados selvagem

NOTA:Os planos para todos os componentes do labirinto Y e da estrutura de contenção são fornecidos no Arquivo Suplementar 2.

1. Componentes do labirinto Y e justificativa para mudanças no design do USDA
   NOTA: O labirinto Y descrito foi significativamente alterado para expandir espécies potenciais de pesquisa e em condições isoladas. A profundidade vertical foi aumentada para acomodar uma variedade de espécies, e diferentes materiais e métodos de construção foram usados para melhorar a durabilidade e limpeza ao ar livre. Consulte a Figura 1 para uma visualização do labirinto completo. Para obter instruções específicas sobre construção e montagem, consulte Arquivo Suplementar 2.
   1. Corte componentes do labirinto Y do polipropileno branco e solda a calor todas as peças cortadas que devem ser permanentemente fixadas (por exemplo, fundo do labirinto e paredes laterais).
      1. Ancore a parte inferior do labirinto Y (244 cm L x 122 cm W) feito de folhas de compensado presas juntamente com parafusos de convés, prendendo-o através de um suporte de ângulo de alumínio rebitado ao longo da parte inferior das paredes laterais externas do labirinto.
      2. Certifique-se de que a base do labirinto Y é de 120 cm L x 42 cm W x 23 cm H, e que cada parede lateral do braço externo é de 120 cm L, a parede lateral do braço interno é de 108 cm L (para direções específicas, ver Arquivo Suplementar 2).
      3. Coloque a parte superior acrílica no lugar usando um ângulo de alumínio fixado nas paredes laterais com parafusos a cada 30 cm (para direções específicas, consulte Arquivo Suplementar 2).
         NOTA: Os parafusos colocados em intervalos regulares na borda superior das paredes laterais do labirinto Y também servem como marcadores visuais estáticos ao analisar o vídeo dos ensaios e fornecem escala.
      4. Certifique-se de que cada abertura do labirinto Y (base, braços) tenha uma placa base adicional (42 cm W x 30 cm H) na extremidade da parede lateral que se prende a uma caixa para que a placa base emquade uma abertura central (34 cm W x 16 cm H; para direções específicas, consulte Arquivo Suplementar 2).
      5. Use uma peça de partição para restringir o acesso do animal perfumado (para direções específicas, consulte Arquivo Suplementar 2). Fixar uma placa de bloqueio (46 cm W x 22 cm H) no lugar usando fita fixa. Ancorar a partição e a placa usando pesos improvisados e facilmente limpos (por exemplo, jarro plástico cheio de água; 2.3.6; Figura 1).
      6. Certifique-se de que as peças de acrílico compõem o topo do labirinto (0,6 cm de espessura, claro). Para obter instruções específicas, consulte Arquivo Suplementar 2.
   2. Use caixas opacas equipadas com porta de correr e tampas que são facilmente protegidas para permitir o transporte e a coleta de animais em ensaios de labirinto Y(Figura 1).
      1. Modifique as caixas (21,6 cm L x 27,9 cm W) com furos de drenagem na parte inferior, encaixe as tampas com parafusos pequenos e porcas e forneça uma única abertura para entrada/saída (a porta). Para obter instruções específicas, consulte Arquivo Suplementar 2.
      2. Fixe a caixa até o final do labirinto Y anexando a placa facial da caixa à placa facial do labirinto Y usando parafusos e asas ou fechaduras.
         NOTA: Quando estiver no local, as caixas também ancoram as peças de topo acrílico no lugar.
2. Configuração da câmera para aquisição de vídeo crepuscular: Veja a Figura 1 para um instantâneo do campo de visão da câmera.
   1. Especificações da câmera: Certifique-se de que a câmera do projeto possa gravar vídeo contínuo sob condições variáveis de luz e temperatura para acomodar espécies de estudo crepuscular e noturno.
      1. Com a câmera do projeto montada nas vigas cruzadas do teto do gabinete, certifique-se de que todo o labirinto Y possa ser capturado dentro do campo de visão da câmera. Levante ou baixe a altura da tenda para aumentar ou diminuir o campo de visão (câmera do projeto montada a uma altura de ~3 m). Certifique-se de que o reflexo da luz infravermelha emitida da câmera na parte superior acrílica não obscurece partes críticas dos quadros nas imagens durante a noite.
   2. Especificações de energia: Certifique-se de que cada câmera de projeto tenha uma fonte de alimentação adequada para gravar vídeo contínuo para filmagens noturnas (aproximadamente 20 h).
      NOTA: Se não houver fonte de alimentação CA disponível, a energia pode ser fornecida usando baterias de 12 volts de ácido de chumbo selado de ciclo profundo (por exemplo, duas baterias de gel 12-V 20-Ah ligadas em paralelo).
   3. Especificações de gravação: Para minimizar o volume de armazenamento do arquivo, registo o vídeo de menor qualidade que ainda é adequado para permitir a contagem de movimentos de língua no labirinto Y.
      NOTA: Imagens de alta resolução exigem grande volume de armazenamento, e reduzir a resolução é uma maneira muito eficaz de garantir que os tamanhos dos arquivos sejam gerenciáveis.
      1. Limitar o framerate (quadros por segundo, FPS) de filmagem ao mínimo necessário para detectar movimentos de língua (por exemplo, resolução de gravação de 800 x 450 com uma taxa de quadro máxima de 25 FPS resulta em aproximadamente.120 GB de filmagem por ensaio).
   4. Protocolo para obtenção e processamento de vídeo
      1. Armar a câmera no início de cada evento de perfumamento (2.3.10), e deixá-la gravar continuamente até o final do evento focal (aproximadamente 20 h).
      2. Após cada teste ser concluído, desligo a câmera e recupere o cartão SD (2.4.4). Transfira a filmagem para o local de armazenamento desejado.
      3. Como os cartões SD frequentemente forçam dispositivos de gravação a gravar imagens em clipes de 5 minutos, combine esses clipes usando software de processamento de filmes para facilitar o processamento.
      4. Revise a filmagem usando um programa de revisão de arquivos de mídia que permite velocidade de reprodução variável e intervalos personalizáveis de salto para a frente.
         NOTA: Isso reduz o tempo de revisão de cerca de 20h para um máximo de 1h se a resolução em escala fina não for necessária durante o processamento do vídeo.
3. Protocolo para executar animais que colocam perfume
   NOTA: As etapas desta seção levarão aproximadamente 1,5 dias para serem concluídas devido a tempos de aclimatação mais longos para répteis selvagens.
   1. Veja o prefácio de viés na seção 1.3.1 para garantir que nenhum viés possa ser encontrado no labirinto.
   2. Use luvas de nitrito ao longo de toda a hora de manusear quaisquer superfícies ou estudar animais para evitar a contaminação do cheiro.
   3. Coloque o animal perfumado ou focal em sua caixa pelo menos 24 horas antes do ensaio para aclimatação.
      NOTA: Para minimizar os efeitos do estresse, a caixa é deixada em uma área sombreada o mais próximo possível do labirinto sem ser perturbada pela limpeza ou outras atividades. Certifique-se de que todos os animais testados (perfumados, focais) estejam aclimatados desta forma.
   4. Prepare papel de perfumamento novo e limpo em uma superfície limpa e de comprimento suficiente para sobrepor-se na junção do Y, e cubra toda a superfície inferior (2 papéis de braço = 121,9 cm; 1 papel base = 152,4 cm).
   5. Proteja as extremidades dos papéis perto das caixas e da junção Y com fita adesiva.
   6. Instale as partições para bloquear metade do braço base (lado esquerdo ou direito) com uma partição longa e bloqueie a entrada do braço oposto com uma pequena partição. Ao instalar as barreiras, não rasgue o papel perfumado. Para animais de grande cheiro, afixe um objeto pesado que pode ser facilmente removido e limpo atrás da barreira como uma cinta para evitar a falha da barreira (2.1.1.5).
      NOTA: A trilha do perfume deve sempre começar em um lado da base, em seguida, cruzar para o braço oposto para que a escolha do animal focal seja clara.
   7. Deslize a parte superior acrílica no lugar, uma seção de cada vez e certifique-se de que os ângulos se encontrem completamente. Use fita plástica transparente para cobrir quaisquer lacunas.
   8. Conecte ambas as caixas de braço ao labirinto conectando as placas faciais usando alásseas e/ou cadeados, e certifique-se de que as portas estão abertas.
   9. Duas horas antes do pôr do sol, conecte a caixa base (contendo o animal perfumado) e garanta que todos os movimentos sejam lentos e constantes para minimizar o estresse ao animal.
   10. Armar a câmera e abrir a porta para a caixa base, com certeza prenderá a porta no lugar usando as duas travas do parafuso do barril. Fique fora da vista do animal, e saia da área.
   11. Após 3h (1h após o pôr do sol), observe a localização do animal dentro do labirinto, bem como as condições ambientais. Se o animal estiver em trânsito, espere até que ele entre na caixa.
       1. Se o animal estiver em alguma caixa, feche e proteja a porta da caixa, retire a caixa e, em seguida, remova o animal, tomando cuidado para evitar o deposição do cheiro defensivo na caixa.
       2. Se o animal estiver imóvel dentro do corpo do labirinto, use pistas visuais (por exemplo, haste longa ou acenando com a mão) para estimular seu movimento em uma caixa. Se o animal permanecer, remova a caixa de braço(es) para que a parte superior acrílica possa ser removida, e o animal possa ser recolhido manualmente e transferido para um saco.
          NOTA: O equipamento de proteção individual adequado (EPI) deve ser sempre usado ao manusear animais de grande porte (por exemplo, luvas resistentes a punção, proteção ocular).
   12. Desmonte parcialmente o labirinto para permitir a remoção das partições internas (evite perturbar o papel-cheiro) e, em seguida, se remonte. Se ocorreu defecação, colete e absorva o máximo possível com panos de microfibra limpos, mas não lave a área.
   13. Prossiga para a seção 2.4 para o protocolo para a execução de animais focais.
4. Protocolo para a execução de animais focais crepusculares
   NOTA: As etapas desta seção levarão aproximadamente 2 dias para serem concluídas e devem começar pelo mesmo horário do início da seção 2.3.
   1. Aclimatar o animal focal programado na caixa por pelo menos 24 horas antes de ser executado em labirinto.
      1. Durante as últimas horas de aclimatação animal focal, execute o animal que pomente o perfume antes de passar para o próximo passo (2.3.9).
         NOTA: Cronometre o passo de colocação do perfume o mais próximo possível do momento da introdução do animal focal ao labirinto para reduzir a degradação do perfume.
   2. Anexar a caixa base (contendo o animal focal) usando porcas de asa e/ou cadeados na base do labirinto Y. Use movimentos lentos e constantes ao segurar/transportar a caixa para minimizar o estresse ao animal focal.
      1. Certifique-se de que ambas as portas da caixa de braço estão abertas. Inicie o ensaio focal abrindo e travando a porta da caixa base usando parafusos de barril. Fique fora da vista do animal e saia da área.
         NOTA: Com ensaios de répteis noturnos selvagens, animais focais são dados durante a noite para explorar o labirinto.
   3. Quatro horas após o nascer do sol, retorne ao labirinto e siga a seção 2.3.11.1 para remover o animal focal.
   4. Colete o cartão SD da câmera e recarregue as baterias se necessário. Descarte o papel usado do labirinto e prossiga para a limpeza (seção 1.5).

Figura 1. Layout do USGS Y-maze. À esquerda, um esquema mostra os componentes do labirinto Y com uma barra de escala para perspectiva. À direita, um instantâneo da câmera de vídeo demonstra o campo de visão para gravações comportamentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

Uma infinidade de variáveis pode ser registrada e/ou pontuada a partir de ensaios y-maze. O desenho do estudo deve ser impulsionado principalmente pelos resultados/resultados desejados. Além disso, se o estudo depende de medidas repetidas (por exemplo, uso repetido dos mesmos animais focais), são necessárias estruturas adequadas de testes e análises. Por exemplo, como os testes do USDA se baseavam em testes repetidos de tegus focais, o planejamento de ensaios experimentais foi totalmente randomizado.

Dados de escolha: A maioria dos estudos que utilizam Y-mazes relatam dados simples de escolha binária e analisam os resultados com estatísticas paramétricas, como um teste binomial. A principal limitação aqui é o tamanho da amostra, que afeta diretamente o poder de qualquer análise estatística. Na Figura 2,uma série de limiares estatísticos por estudo são retratados que demonstram quantos "sucessos" precisariam ocorrer para um determinado teste binômio produzir resultados estatisticamente significativos. Estes são matematicamente derivados e, portanto, generalizáveis para qualquer teste de labirinto Y. As estatísticas binomiais são fáceis de gerar usando freeware on-line. Para calcular probabilidades, as distribuições de uma cauda são usadas se uma lógica a priori for dada; caso contrário, a distribuição de duas caudas deve ser usada.

A escolha de um braço é muitas vezes determinada pela distância que o animal focal se move em um determinado braço. A maneira mais simples de definir esse limiar é estabelecendo um marco dentro do labirinto. Para a maioria dos estudos do labirinto Y, o marco é a entrada da caixa de braço. Como os répteis realizam toda a avaliação quimioensory com os órgãos de sensoriamento químico na região anterior da cabeça, a cabeça é o ponto focal durante um ensaio. Por exemplo, como as pítons birmanesas são muitas vezes mais longas do que todo o labirinto em si, a escolha é melhor e mais eficientemente determinada pelo movimento da cabeça após um marco. Outras opções para determinar a escolha são o tempo gasto em um braço e o movimento completo do animal focal em uma caixa. A falha é determinada por um animal focal que não faz uma escolha dentro de um período específico.

Mais análises de resolução fina podem ser derivadas de dados de escolha no labirinto Y. Por exemplo, os pesquisadores podem gerar uma pontuação de penalidade de escolha¹⁶. Aqui, os pesquisadores devem rastrear o grau em que o animal focal explorou o braço não-alvo do labirinto. O não alvo pode ser definido como o braço que os pesquisadores determinam a priori que o animal focal não escolherá com base na hipótese alternativa testada. O exemplo mais simples de um braço não-alvo seria o braço não perfumado quando apenas um braço contém um cheiro de alvo. Exemplos mais complexos seriam a escolha entre dois aromas da mesma fonte, mas apresentados em concentrações diferentes⁷. Quando o design experimental é multinívelo e/ou os dados vão de binário para incremental, como com a penalidade de escolha, uma abordagem estatística apropriada deve ser usada, como análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) ou outros métodos utilizados com conjuntos de dados contínuos ou proporcionais.

Comportamentos: Ao longo da duração de um experimento no qual os animais focais são observados, uma variedade de comportamentos individuais pode ser quantificada. Esse número de variáveis pode ser determinado a priori dependendo do que é conhecido¹⁶ ou pós-hoc após observações preliminares em um subconjunto de dados^14,15. Os objetivos do estudo e seu grau de resolução determinam quais avaliações comportamentais devem ser feitas dentro do labirinto, se houver (ou seja, em muitos estudos, apenas os dados de escolha são quantificados¹⁷). Comportamentos podem ser avaliados em todo o labirinto, em seções ou em períodos específicos de tempo; por exemplo, comportamentos vistos apenas na base ou na junção dos braços podem ser priorizados⁸. Gravações de vídeo facilitam a pontuação comportamental, embora a resolução do vídeo e seu comprimento — fatores que impõem restrições de armazenamento de dados — sejam considerados antes do início da experimentação.

Variáveis temporais: Como acontece com as variáveis comportamentais, muitos aspectos temporais do desempenho animal podem ser quantificados durante os ensaios do labirinto Y. Por exemplo, os pesquisadores podem cronometrar períodos de latência (por exemplo, latência para emergir da caixa⁸). A maioria das variáveis temporais estão associadas à exploração do labirinto, como o tempo total de arrasto ou o tempo gasto em cada braço. Essas variáveis são geralmente analisadas em uma análise multifatorial, como a ANOVA multi-way.

Viés de observador: Com quaisquer estudos envolvendo comportamento animal, o viés de observador influencia significativamente a coleta de dados¹⁸. Portanto, os observadores devem ser cegos para o tratamento que está sendo testado. A maneira mais simples de fazer isso é codificar os arquivos de vídeo numericamente e, em seguida, classificá-los aleatoriamente (por exemplo, gerador de números aleatórios) antes de atribuí-los aos observadores. Controlar o viés do observador é difícil de ser impossível quando a coleta de dados ao vivo é a única opção. Em um ambiente de campo, isso exigiria dois cooperadores: um observador cego para o tratamento e um coordenador que configura o ensaio. Extensas revisões resumem os efeitos do viés experimentador na coleta e interpretação de dados em estudos comportamentais e ecológicos^18,19.

Figura 2. Tamanhos amostrais e valores P para testes binômios a partir de resultados do labirinto Y. Cada tamanho amostral dado representa um número definido de ensaios onde um cheiro é testado em um braço do Y (braço alvo), enquanto o outro pode ser um controle (não alvo). O número superior acima de cada barra é o valor P de uma cauda para esse número de opções de braço alvo, o fundo é de duas caudas. Os números dentro da barra superior representam o número máximo de opções não-alvo que ainda são tradicionalmente estatisticamente significantes (P < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo. 

Arquivo suplementar 2. Clique aqui para baixar este arquivo. 

Discussion

Embora os labirintos Y sejam ferramentas muito poderosas para investigar a ecologia química em répteis, seu design limitado pode impedir outras vias de investigação. No entanto, uma diversidade de outras opções está disponível^{11,12,20,21,22}. Por exemplo, ensaios de língua-flick são mais simples de executar e permitem a avaliação simultânea de comportamentos exibidos a uma série de estímulos químicos relativos ao controle de odores^23,24,25,26. Testes de campo aberto são outra opção onde um animal focal explora livremente um recinto até encontrar uma fonte de sinais químicos, e suas reações comportamentais são posteriormente pontuadas^27,28. Combinações dessas abordagens podem avaliar capacidades discriminatórias de répteis em contextos variados, como apresentar uma mistura de odores artificiais e naturais junto com a refugia²⁹. Os labirintos Y também podem ser modificados para expor animais a sinais químicos aéreos sozinhos ou em combinação com as pistas de substrato^16,30e inferência pós-hoc podem ser usadas para redesenhar a coleta de dados se os dados de vídeo arquivados estiverem disponíveis³¹. Os bioensadores devem ser projetados para simplificar a coleta de dados e minimizar estímulos conflitantes, especialmente quando uma fonte específica de pistas está sendo avaliada (por exemplo, pistas químicas²¹).

Pesquisadores em comportamento animal frequentemente observam e quantificam respostas focais de animais em ambientes novos e artificiais (por exemplo, um labirinto fechado com uma paisagem sem características), e devem ser tomados cuidados para avaliar se um determinado animal está exibindo comportamento natural, exploratório versus evasão, agitação ou comportamento semelhante angustiado. O comportamento animal angustiado em aparelhos experimentais é atribuído principalmente à neofobia: medo da novidade³². Um exemplo é o comportamento de fuga, onde o animal focal empurra contra as articulações ou as bordas do aparelho para alcançar a saída. Outro exemplo é a timidez, onde o animal focal demonstra relutância em entrar no labirinto, o grau do qual pode ser quantificado pela latência da entrada do labirinto. O aparelho (re)design pode facilitar o engajamento do animal focal para evitar esses efeitos confusos de angústia. A abordagem mais comum é a introdução repetida do animal focal no aparelho para remover a novidade do ambiente antes do início dos testes, e modelos estatísticos contemporâneos (por exemplo, modelos combinados lineares generalizados) permitem que animais de teste sejam usados em múltiplos ensaios. Um ponto importante, relevante para as considerações ecológicas nos testes comportamentais, é que a redução da neofobia está associada ao sucesso das espécies invasoras³³. Assim, dependendo do conhecimento a priori da espécie em questão, a neofobia pode ter importância variável como consideração experimental do design.

A aquisição de dados comportamentais de vídeos impõe múltiplas restrições que se tornam grandes gargalos em cronogramas experimentais. Por exemplo, o comprimento de um determinado ensaio pode aumentar exponencialmente o tempo de extração de dados. Uma solução alternativa é analisar o comportamento apenas até que um limite seja cumprido (por exemplo, tempo total ativo). O limiar pode ser baseado no vídeo mais longo disponível para um determinado teste. Alternativamente, a observação baseada em máquinas (por exemplo, inteligência artificial) pode ser desenvolvida, embora isso seja demorado e consumir recursos com um esforço considerável necessário para o controle de qualidade. Outra questão é o gerenciamento de dados: os vídeos devem ser de qualidade suficiente para permitir a pontuação e avaliação comportamental, resultando em restrições de armazenamento de dados. Embora o armazenamento em nuvem esteja agora acessível, as taxas de upload/download são muitas vezes problemáticas, especialmente quando a aquisição de dados ocorre em locais de campo remoto. Desafios adicionais se manifestam nas limitações das ferramentas de gravação que afetam a integridade da observação comportamental. A visão clara do comportamento focal animal é sempre necessária, mas a visibilidade é frequentemente impedida por fatores incontroláveis (por exemplo, umidade, insetos, movimento do vento). Além disso, quando as gravações vêm de uma única perspectiva (por exemplo, visão do olho do pássaro), comportamentos que ocorrem no plano vertical (por exemplo, aumentos de cabeça¹⁴) são difíceis de avaliar. Uma solução é fornecer múltiplos ângulos de câmera por teste. Por fim, a hora do dia afeta significativamente a gravação comportamental. A análise comportamental noturna requer uma câmera com modo noturno e projeção mínima de luz para evitar brilho obstrutivo na superfície do labirinto Y ou atração de insetos que podem interromper a alimentação da câmera. Considerando o acima, o conhecimento prévio do local de estudo ou biologia das espécies pode informar quais restrições provavelmente ocorrerão com qual frequência e, assim, informar tamanhos amostrais desejáveis.

O comportamento é fortemente associado à fisiologia, e a utilidade dos labirintos Y para avaliação da endocrinologia comportamental em uma variedade de espécies foi demonstrada. No entanto, este artigo enfatiza alguma variação na execução desses experimentos, dependendo das espécies-alvo, questão de pesquisa e recursos disponíveis. Portanto, a seleção de materiais e dimensões de cada configuração de teste deve ser cuidadosamente considerada para potencial expansão subsequente da pesquisa. A Seção 2 descreve modificações feitas em materiais descritos na seção 1, que foram incorporadas para acomodar futuros ensaios comportamentais mais complexos com tegus. O aumento da profundidade vertical dos labirintos de Everglades permitirá que novas perguntas sobre ecologia química em tegus capturados selvagens sejam respondidas sem prolongar indevidamente o projeto e a configuração, demonstrando ainda mais a tradução deste aparelho experimental.

Ao empregar as técnicas acima descritas em um ambiente relativamente remoto (ver seção 2), existem vários fatores limitantes que devem ser considerados, e o planejamento do projeto é primordial. Dependendo do poder estatístico necessário para o experimento de tratamento prescrito e do tempo biológico das espécies-alvo (por exemplo, sazonalidade), os recursos e o trabalho necessários serão afetados. Além disso, se for necessário um uso único ou repetido de animais focais, é necessária uma atenção cuidadosa para reduzir potenciais estressores. Cada um desses fatores estenderá o cronograma do projeto ou exigirá maior mão-de-obra, espaço e materiais. Por exemplo, a seção 2 apresenta o uso de pítons machos capturados selvagem como animais focais atrás de outro grupo de machos capturados selvagens e hormonalmente manipulados, todos os quais requerem aproximadamente 24 horas de tempo de aclimatação silenciosa em caixas de retenção para minimizar os efeitos do estresse. Embora esses períodos de aclimatação tenham estendido os tempos de teste para mais de dois dias, o estresse devido ao cativeiro e manuseio afetam o comportamento dos animais selvagens e devem ser minimizados para gerar conjuntos de dados limpos^34,35.

Em resumo, os labirintos Y são ferramentas poderosas e adaptáveis que podem ser usadas para investigar a ecologia química de diversos animais selvagens em condições amplamente variáveis, desde que haja um planejamento a priori vigilante. Deve-se levar em consideração para escolher as perguntas apropriadas e projetar adequadamente a configuração experimental para determinadas taxas e condições. Pesquisadores e gestores podem se beneficiar significativamente do uso de labirintos Y para entender melhor a biologia quimioensory animal, pois essas ferramentas permitem projetos experimentais flexíveis que fornecem grandes volumes de dados comportamentais em escala fina, especialmente quando combinados com ferramentas de monitoramento remoto.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Braço de canto de aço zincado de 1"	Everbilt, The Home Depot	13619	Veja o Arquivo Suplementar 1, Passo 2.1 "Suporte de canto de aço de 90 graus 2.5 cm"
121.92cm W x 304.8cm  L x 1,27 cm H polipropileno branco Folha UHMW de alta temperatura de alcance estendido	TIVAR	UHMNV SH	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para mudanças no design do USDA " (etapa 2.1.1. "polipropileno branco")
182,88 cm C x 81,28 cm L x 0,64 cm de espessura Folha de acrílico transparente	Plexiglass	32032550912090	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para mudanças no projeto do USDA " (etapa 2.1.1.6. "Peças acrílicas")
2,54 cm L x 2,54 cm A x 243,84 cm L	Siderúrgicas	11354	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no projeto do USDA " (etapa 2.1.1.1. "suporte angular de alumínio")
Carretel de 4.5 kg de hastes de solda redondas de polipropileno de 5 mm	HotAirTools	AS-PP5N10	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no projeto do USDA " (etapa 2.1.1. "solda a quente")
Rebites de alumínio liso de 5 mm	Seta	RLA3/16IP	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no projeto do USDA " (etapa 2.1.1.1. "rebite")
Ângulo de alumínio, 1,9 cm	Everbilt, The Home Depot	802527	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 1.2 "ângulo de alumínio (1,9 cm x 1,9 cm x 0,16 cm de espessura)"
Ângulo de alumínio, 2,5 cm	Everbilt, The Home Depot	800057	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapas 1.2 e 2.2.2 "ângulo de alumínio (2.5 cm x 2.5 cm x 0.16 cm de espessura)"
Ângulo de alumínio, 3.2 cm	Everbilt, The Home Depot	800037	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 1.2 "ângulo de alumínio (3.2 cm x 3.2 cm x 0.16 cm de espessura)"
Barra plana de alumínio 1" x 1/8" de espessura	Everbilt, The Home Depot	801927	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 3.2.1 "pulseira de alumínio"
Câmera Avigilon 2.0 MP	Avigilon, uma empresa de soluções Motorola	2.0C-H4SL-BO1-IR	Consulte "1.5 Configuração da câmera e aquisição de vídeo" (etapa 1.5.1 "Avigilon 2.0 MP")
Avigilon NVR	Avigilon, uma empresa de soluções da Motorola	HD-NVR3-VAL-6TB-NA	Consulte "1.5 Configuração da câmera e aquisição de vídeo" (etapa 1.5.3 "NVR")
Folha acrílica transparente (5,6 mm de espessura)	United States Plastic Corp.	44363	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 1.3 "folha de acrílico transparente" e etapa 3.2.1 "porta de acrílico transparente"
Bico de solda de filete 3/16" x 15/32" / 4.5 x 12 mm	TRIAC	107.139	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no projeto do USDA " (etapa 2.1.1. "solda a quente")
Caixa de pasta de arquivo suspensa	Sterilite	18689004	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no projeto do USDA " (etapa 2.1.2.1. "Caixas")
HardiePanel HZ10	James Hardie Building Products	9000525	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 1.1 "revestimento de fibrocimento"
Pistola de solda a quente	TRIAC	141.227	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para mudanças no design do USDA" (etapa 2.1.1. "solda a quente")
Rolo de Papel Vegetal Kraft, 24 "	Bryco Goods	24 polegadas x 175 FT	Veja "1.2 Protocolo para execução de tegus de colocação de perfume" (etapa 1.2.1.2 "papel pardo")
Rolo de Papel Vegetal Kraft, 46 cm de largura	Bryco Goods	BGKW2100	Ver "2.3. Protocolo para executar pítons que colocam cheiro" (passo 2.3.4. "papel perfumado")
Solução de Limpeza Concentrada Micro-90	International Products Corporation	M-9050-12	Consulte "1.4 Detalhamento e limpeza" (etapa 1.4.4 "sabão de grau de laboratório")
MKV ToolNix - Ferramentas Matroska para linux/Unix e Windows	Moritz Bunkus	v.48.0.0	Consulte "2.2. Configuração da câmara e aquisição de vídeo" (passo 2.2.4.2. "software de processamento de filmes")
Câmara de rede	Axis Communications	M3104-LVE	Consulte "2.2. Configuração da câmera e aquisição de vídeo" (etapa 2.2.1. "Câmera do projeto")
Palight ProjectPVC 1/4"	Palram	159841	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no projeto do USDA " (etapa 2.1.2.3. "placa frontal")
Projeto PalightPVC 1/8"	Palram	156249	Consulte "2.1. Componentes do labirinto em Y e justificativa para alterações no design do USDA " (etapa 2.1.2.1. "porta")
Pára-brisas de privacidade (verde)	MacGregor	Tamanho para caber	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 4.2 "pano de sombra verde resistente"
Luva de proteção, armadura de dedo inteiroOU	Mão	HS1010-RGXL	Consulte "2.3. Protocolo para executar pythons que colocam cheiro" (etapa 2.3.11.2. NOTA: "luva resistente a perfurações")
REScue Desinfetante	Virox Saúde Animal	44176	Consulte "1.5. Avaria e limpeza." (passo 1.5.4. NOTA "solução de higienização")
Guarnição de PVC reversível, 1/2" x 24"	UFP Industries, produtos de varanda	H120XWS17	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 2.1 "Divisória de placa de PVC" e a etapa 3.2.1 "Placas de acabamento de PVC mais finas"
S4S / Varanda HP TRIM	UFP Industries, produtos de varanda	H190OWS4	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapas 1.2, 2.2.2 e 2.2.3 "Placa de PVC"
S4S / Veranda HP TRIM (1" x 8" Nominal)	UFP Industries, Produtos Veranda	827000005	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapas 3.2.1 "Placa de acabamento em PVC"
ScotchBlue 24 pol. Pintor pré-gravado' s Plastic	3M	PTD2093EL-24-S	Consulte "1.2 Protocolo para execução de tegus de colocação de perfume" (etapa 1.2.1.3 "folha de plástico")
Sterilite 114 L caixa de caixa	Sterilite Company	1919, Aço	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 3.2 "caixa de braço"
Sterilite 189 L caixa de caixa	Sterilite Company	1849, Titânio	Consulte o Arquivo Suplementar 1, Etapa 3.2 "Caixa de base"
Super Max Canopy	ShelterLogic	25773	Veja o Arquivo Suplementar 1, Etapa 4.3 "white canopy"
VLC Media Player	VideoLAN	v.3.0.11	Veja "2.2. Configuração da câmera e aquisição de vídeo" (etapa 2.2.4.3. "programa de revisão de arquivos de mídia")
White Pavilion Tent	King Canopy	BJ2PC	Consulte o Arquivo Complementar 2 "3. Materiais e considerações do recinto" (etapa 3. "tenda do pavilhão")