자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징
Summary
자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.
Abstract
지질 대사는 세포 와 유기체 건강에 필요한 기본적인 생리 과정입니다. 지질 대사의 dysregulation는 수시로 심장 혈관 무질서, 타입 II 당뇨병 및 암을 포함하여 비만 및 많은 관련질병을 유도합니다. 지질 대사 조절의 현재 이해를 증진하기 위해, 시간과 공간에서 생체 지질 저장 수준을 정확하게 측정하는 정량적 방법은 점점 더 중요하고 유용해지고 있다. 지질 저장을 분석하는 전통적인 접근 방식은 현미경 평가를 위한 반정성 또는 생화학적 측정을 위한 spatio-측두성 정보 부족입니다. 자극된 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 세포 외 분해능을 가진 살아있는 세포에서 지질을 신속하고 정량적 검출할 수 있는 라벨이 없는 화학 영상 기술입니다. 본질적인 분자 진동에서 대조가 악용됨에 따라 SRS 현미경 검사법은 살아있는 동물의 지질을 4차원 추적할 수 있습니다. 지난 10년 동안, SRS 현미경 검사는 생체 의학 연구에서 작은 분자 이미징에 널리 사용되었으며 기존의 형광 염색 및 지질 추출 방법의 주요 한계를 극복했습니다. 실험실에서, 우리는 강력한 모형 유기체, Caenorhabditis elegans에 유효한 유전 및 생화학 공구와 SRS 현미경 검사를 결합했습니다, 다른 세포및 조직에 걸쳐 지질 물방울의 분포 그리고 이질성을 조사하고 궁극적으로 지질 대사를 조절하는 새로운 보존된 신호 통로를 발견하기 위하여. 여기서, 우리는 SRS 현미경의 작업 원리및 상세한 설정을 제시하고 야생 형 및 인슐린 신호 결핍 돌연변이 C. elegans의뚜렷한 발달 시점에서 지질 저장을 정량화하는 데 사용하는 방법을 제공합니다.
Introduction
비만은 전 세계 인구의 3분의 1을 위협하는 글로벌 건강 문제가 되었으며, 당뇨병 2, 심혈관 질환3 및 일부 유형의암4를포함한 정신 건강1 및 치명적인 질병과의 연관성을 감안할 때 심각한 의학적 우려를 제시하고 있다. 지질 대사의 연구는 비만 뒤에 생물학 문제를 더 잘 이해하기 위하여 필수적입니다. 지질 저장의 신속하고 구체적인 정량화는 지방산및 그 유도체의 검출뿐만 아니라 스테롤 함유 대사산물의 검출을 수반하며, 높은 감도와 바람직하게는 공간 정보로 수반된다. 지질은 본질적인 형광이 부족하고 쉽게 형광 태그가 될 수 없기 때문에 이미지에 도전적인 표적입니다. 형광 태그는 종종 지질 분자보다 더 크므로 생체 응용 분야에서 화학적으로 침습적이고 비실용적 일 수 있습니다. 지질 분자의 소수성 구조를 보존하기 위해서는 라벨이 없거나 최소한의 라벨링 전략이 필요하다5. 이미징 기술의 최근 발전은 살아있는 세포, 조직 및 유기체에 있는 지질의 레이블 없는 화상 진찰을 위한 흥미진진한 기회를 만들었습니다.
생물학적 샘플에서 지질 저장 분석을 위한 전통적인 접근은 심포성 염료를 가진 생화학적인 분석 및 염색 프로토콜을 포함합니다. 질량 분석법(MS)을 포함하는 생화학적 정량화 분석법은 분자 재사용과 비교할 수 없지만, 매우 많은 샘플 양이 필요하며 샘플 준비는 보통 몇 시간이 걸리며, 생활 시스템의 실시간 이미징을 위한 적용을 제한합니다5. 이러한 분석의 또 다른 주요 제한은 공간 정보의 부족이다. 한편, 오일 레드 O와 수단 블랙과 같은 지질성 염료는 지질 저장 소기관의 조직 및 세포 분포를 제공하고 MS 기술에 비해 이러한 염색 방법도 비용이 낮고 수행하기 쉽습니다. 그러나, 이러한 염색 프로토콜은 지질 방울의 소수성 특성에 영향을 미칠 수 있는 고정을 필요로 하며, 그 구조에 인위적인 변화를 일으키고 실험6사이의 불일치를 초래한다. 생화학 및 염색 기술과 관련된 기술적 어려움은 지질 분자를 이미지화하고 지질 이미징에서 일관된 라만 산란 (CRS) 현미경 검사법의 사용이 급격히 증가하는 라벨없는 방법을 찾는 데 주도했습니다.
라만 효과는 라만과 크리슈난에 의해 처음 인식되었으며, 광자와 상호 작용할 때 분자는 파장의 변화없이 산란된 빛을 생성할 수 있다고 보고했습니다(레일리 산란이라고 함) 또는 파장의 변화는 분자7내의 기능성 화학 군의 특징이다. 분자 내의 화학 결합이 펌프 광자라고 불리는 사건 광자에 의해 더 높은 진동 에너지 레벨에 흥분하면 스토크스 광자라고 불리는 흩어진 광자의 에너지가 낮아집니다. 그렇지 않으면, 화학 결합은 원래 더 높은 수준에 있는 경우 낮은 진동 에너지 수준에 도달할 수 있고, 흩어져 있는 광자는 안티 스토크스 광자될 에너지를 얻는다. 인시던트와 흩어진 광자의 빈도 차이를 라만 시프트라고 합니다. 분자 내의 각 화학 결합은 특징적이고 정량화 가능한 라만 시프트를 갖는다. 예를 들어,CH2 결합은 지방산 사슬8이풍부한 2,845cm-1의 라만 시프트를 갖는다. 이 자발적인 라만 신호는 일반적으로 매우 약하며, 이는 기존의 자발적인 라만 현미경 검사법의 이미징 속도를 크게 제한합니다. 수년에 걸쳐, 자발적인 라만 현미경 검사법의 화상 진찰 속도 및 감도를 높이기 위하여 각종 접근이 개발되었습니다. 일관된 라만 산란 현미경 검사법은 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법과 자극 라만 산란 (SRS) 현미경 검사를 포함하여, 가장 최근의 진행이다. CARS와 SRS는 약간 다른 작동 원리를 가지고 있지만, 둘 다 라이브 이미징 기능을 가진 라벨이 없는 기술이며, 지질 저장 역학에 대한 공간 및 시간 정보를 얻을 수 있으며 작은 샘플 크기만 필요합니다. CARS 현미경 검사는 다양한 비선형 공정에서 비롯된 비공명 배경으로 고통받고 있으며, CARS 신호는 또한 분자 농도와 비선형관계를 가지며, 이는 함께 정량화 공정9을복잡하게 한다. CARS 현미경 검사법과 달리 SRS 현미경 검사는 불공명 배경 신호를 생성하지 않으며 관심 분자의 농도에 선형 의존성을 제공합니다. 따라서, 현재 SRS 현미경 검사는 지질 이미징에 더 널리 사용된다.
SRS 현미경 검사법에서, 약한 자발적인 라만 신호는 화학 결합 진동 주파수와 일치하는 주파수 차이와 두 개의 동기화 된 레이저 빔에 의해 흥분 될 때 증폭 될 수있다. 분자는 일관된 흥분된 흥분으로 인해 흥분된 상태로의 향상된 전환을 경험하게 될 것입니다. 그 결과, 스토크스 광자 세대의 비율이 향상됩니다. 따라서, 전송된 “Stokes” 빔의 강도(자극라만 게인, SRG)와 전송된 “펌프” 빔의 강도가 감소합니다(라만 손실, SRL 자극). SRG 또는 SRL 신호의 검출은 특정 화학 결합을 가진 분자의 자극된 라만 산란(SRS) 현미경 이미징의기초가 10을기초로 한다. 두 레이저 빔 간의 주파수 차이가 관심 분자 내의 화학 결합의 진동 주파수와 일치하지 않으면 SRG 또는 SRL 신호가 생성되지 않습니다. SRS 현미경 검사법의 이미징 속도는 픽셀당 약 2 μsec 또는 프레임당 1초이며, 이는 자발적인 라만 현미경 검사법11보다훨씬 빠릅니다. SRS 현미경 검사법에 대한 일반적인 측면 해상도는 회절이 제한되고 약 300 nm입니다. 또한, SRS 현미경 검사법의 2광광 광학 공정은 상대적인 두꺼운 조직 샘플의 체피 3D 이미징을 허용하고 이미징 깊이는 300-500 μm에 도달 할 수 있습니다. 전반적으로, SRS 현미경 검사는 특정 생체 분자, 특히 지질을 검출하기 위하여 능률적인, 레이블없는 화상 진찰 기술을 제시합니다.
지질 방울은 트리아실글리세롤(TAGs) 및 콜레스테롤 에스테르(CEs)를 포함한 중성 지질의 주요 세포 저장 사이트인 단일 멤브레인 세포기관입니다. 이들 지질 분자의 지방산 사슬에 있는CH2 결합은8을흥분할 때 2,845cm-1에서 강한 SRS 신호를 생성하여, 따라서 온전한 세포, 조직 단면 및 전체 유기체 12,13,14,15에서저장 지질 수준의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 특히, C. elegans는 그들의 투명성 때문에 지질 화상 진찰 연구 결과에 유용합니다. 포유류와 마찬가지로, C. elegans는 지질 물방울에 지질을 저장하고 지질 분자의 합성 및 분해 경로는 매우보존된다 16. 이 프로토콜에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 작동 원리, 그것의 근본적인 설치를 제공하고 C. elegans에있는 지질 화상 진찰에 그것의 사용을 위한 방법을 설명할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비만과 그 관련 신진 대사 무질서에 대하여 방어에서, 지질 항상성의 규정 기계장치를 더 잘 이해하기 위하여 중요한 연구 노력이 실행되었습니다. 생물학적 샘플에서 지질 분자의 정량적 검출을 위해 SRS 현미경 검사법에 의한 라벨 없는 이미징은 생화학 적 분석 및 기타 염색 방법에 대한 신뢰할 수있는 대안으로 입증되었습니다. 우리 그룹 및 다른 사람들은 C. elegans 및 SRS 현미경<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W에 의해 지원되었다.), DP1DK113644 (M.C.W.), 디임스 재단 (M.C.W.), 웰치 재단 (M.C.W.), HHMI 조사관 (M.C.W.). 우리는 C. elegans 균주에 대한 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 감사드립니다.
Materials
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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