Label-Free Imaging af Lipid Storage Dynamics i Caenorhabditis elegans ved hjælp af stimuleret Raman Scattering Mikroskopi
Summary
Stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi giver mulighed for selektiv, etiket-fri billeddannelse af specifikke kemiske moieties og det er blevet effektivt ansat til at billedet lipid molekyler in vivo. Her giver vi en kort introduktion til princippet om SRS mikroskopi og beskrive metoder til dets anvendelse i billedbehandling lipid opbevaring i Caenorhabditis elegans.
Abstract
Lipidmetabolisme er en grundlæggende fysiologisk proces, der er nødvendig for cellulær og organisme sundhed. Dysregulering af lipidmetabolisme fremkalder ofte fedme og mange tilknyttede sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme, type II-diabetes og kræft. For at fremme den nuværende forståelse af lipid metabolisk regulering, kvantitative metoder til præcist at måle in vivo lipid opbevaringsniveauer i tid og rum er blevet stadig vigtigere og nyttige. Traditionelle metoder til at analysere lipidlagring er semiktativ for mikroskopisk vurdering eller mangler spatio-tidsmæssige oplysninger til biokemisk måling. Stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi er en etiket-fri kemisk billeddannelse teknologi, der muliggør hurtig og kvantitativ påvisning af lipider i levende celler med en subcellulær opløsning. Da kontrasten udnyttes fra iboende molekylære vibrationer, tillader SRS-mikroskopi også firedimensionel sporing af lipider hos levende dyr. I det sidste årti har SRS mikroskopi været meget anvendt til små molekyle billeddannelse i biomedicinsk forskning og overvinde de store begrænsninger af konventionelle fluorescerende farvning og lipid ekstraktion metoder. I laboratoriet har vi kombineret SRS-mikroskopi med de genetiske og biokemiske værktøjer, der er tilgængelige for den magtfulde modelorganisme, Caenorhabditis elegans, for at undersøge fordelingen og heterogeniteten af lipiddråber på tværs af forskellige celler og væv og i sidste ende for at opdage nye bevarede signalveje, der modulerer lipidmetabolisme. Her præsenterer vi arbejdsprincipperne og den detaljerede opsætning af SRS-mikroskopet og giver metoder til dets anvendelse til kvantificering af lipidlagring på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter af vildtype og insulinsignalerende mangelfuld mutant C. elegans.
Introduction
Fedme er blevet et globalt sundhedsproblem, der truer en tredjedel af befolkningen rundt om i verden, og det udgør en alvorlig medicinsk bekymring i betragtning af dets tilknytning til dårlig mental sundhed1 og dødelige sygdomme, herunder diabetes2, hjerte-kar-sygdomme3 og nogle typer kræft4. Undersøgelse af lipidmetabolisme er afgørende for bedre at forstå de biologiske problemer bag fedme. Hurtig og specifik kvantificering af lipidopbevaring indebærer påvisning af fedtsyrer og derivater heraf samt sterolholdige metabolitter med høj følsomhed og helst med rumlig information. Lipider er udfordrende mål til billedet, fordi de mangler iboende fluorescens og kan ikke let fluorescerende mærkes. De fluorescerende tags er ofte større end lipidmolekylerne og kan derfor være kemisk invasive og upraktiske til in vivo-applikationer. Etiketfri eller minimal mærkningsstrategi er nødvendig for at bevare lipidmolekylernes hydrofobe struktur5. Den seneste udvikling inden for billeddannelsesteknologier har skabt spændende muligheder for etiketfri billeddannelse af lipider i levende celler, væv og organismer.
Traditionelle tilgange til lipidlagringsanalyser i biologiske prøver omfatter biokemiske analyser og farvningsprotokoller med lipofile farvestoffer. Biokemiske kvantificeringsanalyser, der involverer massespektrometri (MS), er uovertruffen i deres molekylære opløsning, men de kræver meget store prøvemængder, og prøveforberedelse tager normalt flere timer, hvilket begrænser deres anvendelse til realtidsbilleddannelse af levende systemer5. En anden væsentlig begrænsning af disse analysemetoder er manglen på geografisk information. På den anden side giver lipofile farvestoffer som Oil Red O og Sudan Black væv og cellulær distribution af lipidopbevaringsorganeller, og sammenlignet med MS-teknikker er disse farvningsmetoder også lave i omkostninger og lette at udføre. Disse farvningsprotokoller kræver imidlertid fiksering, hvilket kan påvirke lipiddråbernes hydrofobe karakter, generere kunstige ændringer i deres struktur og resultere i uoverensstemmelser mellem forsøg6. De tekniske vanskeligheder forbundet med biokemiske og farvning teknikker har ført til søgen efter etiket-fri metoder til at billedet lipid molekyler og til den hurtige stigning i brugen af sammenhængende Raman spredning (CRS) mikroskopi i lipid imaging.
Raman-effekten blev først anerkendt af Raman og Krishnan, hvor de rapporterede, at ved interaktion med en foton kan et molekyle generere spredt lys uden ændring i bølgelængde (kaldet Rayleigh-spredning) eller sjældent med en ændret bølgelængde (kaldet Raman-spredning), og denne ændring i bølgelængde er karakteristisk for de funktionelle kemiske grupper inden formolekylet 7. Når de kemiske bindinger i et molekyle bliver ophidset til et højere vibrationelt energiniveau af en hændelsesfoton, kaldet pumpefoton, bliver energien fra den spredte foton, kaldet Stokes photon, lavere. Ellers kan de kemiske bindinger nå et lavere vibrationelt energiniveau, hvis de oprindeligt er på et højere niveau, og den spredte foton får energi til at være anti-Stokes foton. Frekvensforskellen mellem hændelsen og spredte fotoner er kendt som Raman-skiftet. Hver kemisk binding i et molekyle har et karakteristisk og kvantificerbart Raman-skift. For eksempel har CH2-bindingen et Raman-skift på 2.845 cm-1, hvilket er rigeligt i fedtsyrekæder8. Dette spontane Raman-signal er generelt meget svagt, hvilket har stærkt begrænset billedhastigheden i konventionel spontan Raman-mikroskopi. I årenes løb er der udviklet forskellige tilgange til at øge billedhastigheden og følsomheden af spontan Raman-mikroskopi. Sammenhængende Raman sprede mikroskopi, herunder sammenhængende Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) mikroskopi og stimuleret Raman Scattering (SRS) mikroskopi, er den seneste fremskridt. CARS og SRS har lidt forskellige arbejdsprincipper, men begge er etiketfri teknikker, der har levende billeddannelseskapacitet, kan give rumlig og tidsmæssig information om lipidlagringsdynamik og kræver kun lille prøvestørrelse. CARS mikroskopi lider af ikke-resonant baggrund, som kommer fra forskellige ikke-lineære processer, og CARS-signaler har også ikke-lineært forhold til molekylekoncentrationen, hvilket tilsammen komplicerer kvantificeringsprocessen9. I modsætning til CARS mikroskopi genererer SRS-mikroskopi ikke ikke-resonante baggrundssignaler og tilbyder lineær afhængighed af koncentrationen af molekylet af interesse. Således er I øjeblikket SRS mikroskopi mere udbredt til lipid imaging.
I SRS mikroskopi, kan de svage spontane Raman signaler forstærkes, når ophidset af to synkroniserede laserstråler med deres frekvens forskel matcher den kemiske binding vibrationelle frekvens. Molekylet vil opleve en forbedret overgang til en ophidset tilstand på grund af sammenhængende excitation. Som et resultat, er antallet af Stokes foton generation boostet. Derfor øges intensiteten af den transmitterede “Stokes” stråle (stimuleret Raman gevinst, SRG) og intensiteten af den transmitterede “pumpe” stråle falder (stimuleret Raman tab, SRL). Påvisning af SRG- eller SRL-signaler ligger til grund for grundlaget for stimuleret Raman Scattering (SRS) mikroskopibilleddannelse af molekyler med specifikke kemiske bindinger10. Hvis frekvensforskellen mellem de to laserstråler ikke svarer til vibrationsfrekvensen for den kemiske binding inden for et molekyle af interesse, genereres der hverken SRG- eller SRL-signaler. Billedhastigheden af SRS-mikroskopi er omkring 2 μsec pr. pixel eller 1 sekund pr. ramme, hvilket er meget hurtigere end spontan Raman-mikroskopi11. Typisk sideværts opløsning for SRS mikroskopi er diffraktion begrænset og omkring 300 nm. Desuden giver de to fotonoptiske processer for SRS-mikroskopi mulighed for volumetrisk 3D-billeddannelse af relative tykke vævsprøver, og billeddybden kan nå op på 300-500 μm. Samlet set præsenterer SRS-mikroskopi en effektiv, etiketfri billedteknik til at opdage specifikke biomolekyler, især lipider.
Lipiddråber er enkeltmembranorganeller, som er det vigtigste cellulære opbevaringssted for neutrale lipider, herunder triacylglyceroler (TAGs) og kolesterolestere (CEs). CH2 bindinger i fedtsyre kæder af disse lipid molekyler generere stærke SRS signaler på 2.845 cm-1, når ophidset8, hvilket gør det muligt at opdage og kvantificere opbevaring lipid niveauer i intakte celler, væv sektioner og endda hele organismer12,13,14,15. Især C. elegans er nyttige til lipidbilledundersøgelser på grund af deres gennemsigtighed. Ligesom pattedyr, C. elegans også gemme lipider i lipid dråber og syntese og nedbrydning veje lipid molekyler er stærkt bevaret16. I denne protokol vil vi levere arbejdsprincippet for SRS-mikroskopi, dets grundlæggende opsætning og beskrive metoderne til dets anvendelse i lipidbilleddannelse i C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til forsvar mod fedme og de tilhørende metaboliske lidelser er der gennemført vigtige forskningsindsatser for bedre at forstå de lovgivningsmæssige mekanismer i lipidhomøostase. Til kvantitativ påvisning af lipidmolekyler i biologiske prøver har etiketfri billeddannelse ved SRS-mikroskopi vist sig at være et pålideligt alternativ til biokemiske assays og andre farvningsmetoder. Vores gruppe og andre har afsløret nye biologiske mekanismer i lipid metabolisk regulering ved at kombinere brugen af C. elegans</e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), Marts Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), og af HHMI investigator (M.C.W.). Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC) for C. elegans stammer.
Materials
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
Referências
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genética. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genética. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
