刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング
Summary
刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡検査は、特定の化学部分の選択的でラベルフリーなイメージングを可能にし、生体内の脂質分子を画像化するために効果的に採用されています。ここでは、SRS顕微鏡の原理を簡単に紹介し、 カエノハブディティス・エレガンスにおける脂質貯蔵のイメージングにおけるその使用法について説明する。
Abstract
脂質代謝は、細胞や生物の健康に必要な基本的な生理学的プロセスです。脂質代謝の調節不調整は、しばしば肥満を引き起こすと心血管障害を含む多くの関連疾患, II型糖尿病, 癌.脂質代謝調節の現在の理解を進めるために、時間と空間で生体内脂質貯蔵レベルを正確に測定する定量的方法がますます重要かつ有用になってきています。脂質蓄積を分析する従来のアプローチは、微視的な評価のために半定量的であるか、生化学的測定のための時空間的な情報を欠いている。刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は、細胞内分解能を持つ細胞内の脂質を迅速かつ定量的に検出できる、ラベルフリーの化学イメージング技術です。このコントラストは固有の分子振動から利用され、SRS顕微鏡検査は生きている動物の脂質の4次元追跡も可能にする。過去10年間、SRS顕微鏡は、生物医学研究における低分子イメージングに広く使用され、従来の蛍光染色法および脂質抽出法の大きな限界を克服してきました。研究室では、強力なモデル生物 であるカエノハブディティス・エレガンス が利用できる遺伝的および生化学的ツールとSRS顕微鏡を組み合わせて、異なる細胞および組織にわたる脂質滴の分布と不均一性を調べ、最終的には脂質代謝を調節する新しい保存シグナル伝達経路を発見しました。ここでは、SRS顕微鏡の働く原理と詳細な設定を提示し、野生型およびインスリンシグナル伝達欠損変異体 C.エレガンスの異なる発達時点における脂質貯蔵の定量に使用する方法を提供する。
Introduction
肥満は世界中の人口の3分の1を脅かす世界的な健康問題となっており、貧しい精神的健康1 と糖尿病2、心血管疾患3 およびいくつかのタイプの癌を含む致命的な疾患との関連を考えると、深刻な医学的懸念を提示する。肥満の背後にある生物学的問題をよりよく理解するためには脂質代謝の研究が不可欠です。脂質の迅速かつ特異的な定量化は、脂肪酸およびその誘導体、ならびにステロール含有代謝産物の検出を伴い、高感度で、好ましくは空間情報を有する。脂質は、本来の蛍光性を欠き、蛍光タグ付けが容易にできないため、画像に挑戦的なターゲットです。蛍光タグは、多くの場合、脂質分子よりも大きく、したがって、生体内の適用のために化学的に侵襲的で実用的でなくなることができます。脂質分子5の疎水構造を維持するためには、ラベルフリーまたは最小限の標識戦略が必要である。近年のイメージング技術の発展は、生細胞、組織、生物における脂質の標識のないイメージングの機会を生み出しています。
生体試料における脂質保存分析の従来のアプローチには、生化学的アッセイや脂溶性染料による染色プロトコルが含まれます。質量分析(MS)を含む生化学的定量アッセイは、その分子の解決性において比類のないものですが、非常に大きなサンプル量を必要とし、サンプル調製には通常数時間かかり、生体システムのリアルタイムイメージングへの応用を制限します5。これらのアッセイのもう一つの大きな制限は、空間情報の欠如である。一方、オイルレッドOやスーダンブラックなどの親油性色素は、脂質貯蔵小器官の組織および細胞分布を提供し、MS技術と比較して、これらの染色法も低コストで、かつ実行しやすい。しかし、これらの染色プロトコルは固定を必要とし、脂質滴の疎水性に影響を与え、その構造に人工的な変化を生じ、実験6の間に矛盾を生じる。生化学的および染色技術に関連する技術的な困難は、脂質分子を画像化するためのラベルフリーの方法の探索と、脂質イメージングにおけるコヒーレントラマン散乱(CRS)顕微鏡の使用の急速な増加につながっている。
ラマン効果は、ラマンとクリシュナンによって最初に認識され、光子と相互作用すると、分子が波長の変化(レイリー散乱と呼ばれる)または変化した波長(ラマン散乱と呼ばれる)でめったに散乱光を生成することができ、この波長の変化は分子内の官能化学基の特徴であると報告した。分子内の化学結合がポンプ光子と呼ばれる入射光子によってより高い振動エネルギーレベルに励起されると、ストークス光子と呼ばれる散乱光子のエネルギーが低くなる。さもなければ、化学結合はもともとより高いレベルにあるならばより低い振動エネルギーレベルに達し、散乱された光子は反ストークス光子になるエネルギーを得る。インシデントと散乱フォトンの周波数差は、ラマンシフトと呼ばれます。分子内の各化学結合は、特徴的かつ定量的なラマンシフトを有する。例えば、CH2結合は、2,845cm-1のラマンシフトを有し、これは脂肪酸鎖8に豊富である。この自発的なラマン信号は一般的に非常に弱く、従来の自発的なラマン顕微鏡ではイメージング速度が大幅に制限されています。また、自発ラマン顕微鏡のイメージング速度と感度を高めるさまざまなアプローチが長年にわたって開発されてきました。コヒーレント・アンチ・ストークス・ラマン散乱(CARS)顕微鏡検査や刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡など、コヒーレントラマン散乱顕微鏡が最新の進歩である。CARSとSRSは、わずかに異なる動作原理を持っていますが、どちらもライブイメージング機能を備え、脂質貯蔵ダイナミクスに関する空間的および時間的な情報を生成することができ、小さなサンプルサイズしか必要としなくて済むラベルフリーの技術です。CARS顕微鏡は、様々な非線形プロセスに由来する非共振性バックグラウンドに苦しんでおり、CARS信号も分子濃度と非線形関係を有し、定量プロセス9を一緒に複雑にする。CARS顕微鏡とは異なり、SRS顕微鏡は非共振性のバックグラウンド信号を生成せず、対象分子の濃度に直線的に依存します。従って、現在SRS顕微鏡は、より広く脂質イメージングに使用されている。
SRS顕微鏡では、弱い自発的なラマン信号は、化学結合振動周波数と一致する周波数差を持つ2つの同期レーザービームによって励起されたときに増幅することができる。分子は、一貫した励起のために励起状態への遷移を増強する。その結果、ストークスフォトン生成の速度が上昇する。その結果、送信された「ストークス」ビームの強度が増加し(刺激されたラマンゲイン、SRG)、送信された「ポンプ」ビームの強度が減少する(刺激されたラマン損失、SRL)。SRGまたはSRL信号の検出は、特異的化学結合10を有する分子の刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡イメージングの基礎となる。2つのレーザービーム間の周波数差が目的の分子内の化学結合の振動周波数と一致しない場合、SRG信号もSRL信号も生成されません。SRS顕微鏡のイメージング速度は、ピクセルあたり約2μsecまたはフレームあたり1秒で、自発的なラマン顕微鏡11よりもはるかに高速です。SRS顕微鏡の典型的な横解像度は、回折限であり、約300nmである。さらに、SRS顕微鏡の2光子光学プロセスにより、相対厚組織サンプルの体積3Dイメージングが可能となり、イメージング深度は300〜500μmに達する可能性があります。全体として、SRS顕微鏡は、特定の生体分子、特に脂質を検出するための効率的でラベルフリーなイメージング技術を提示します。
脂質滴は、トリアシルグリセロール(TAG)およびコレステロールエステル(CE)を含む中性脂質の主な細胞貯蔵部位である単膜小器官である。これらの脂質分子の脂肪酸鎖中のCH2結合は、励起された2,845cm-1で強いSRSシグナルを生成し、インタクトな細胞、組織切片、さらには生物全体12、13、14、15の保存脂質レベルの検出および定量を可能にする。特に、C.エレガンスは、その透明性のために脂質イメージング研究に有用である。哺乳類と同様に、C.エレガンスも脂質滴に脂質を保存し、脂質分子の合成および分解経路は高度に保存されている16である。このプロトコルでは、SRS顕微鏡の原理を提供し、その基本的な設定を行い、C.エレガンスにおける脂質イメージングにおける使用法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
肥満およびそれに関連する代謝障害に対する防御において、脂質恒常性の調節機構をよりよく理解するための重要な研究努力が実施されている。生体試料中の脂質分子の定量的検出では、SRS顕微鏡による標識のないイメージングが、生化学的アッセイやその他の染色法に代わる信頼性の高い方法であることが証明されています。我々のグループ及び他の人々は、C.エレガンスとSRS顕微?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金R01AG045183(M.C.W.)、R01AT009050(M.C.W.)、R01AG062257(M.C.W)によってサポートされました DP1DK113644(M.C.W.)、ダイムズ財団の行進(M.C.W.)、ウェルチ財団(M.C.W.)、HHMI調査官(M.C.W.)。私たちは 、C.エレガン ス株のためのカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)に感謝します。
Materials
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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