A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.
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Artigo de método
Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada
Neste artigo
Resumo
Resumo
O metabolismo lipídico é um processo fisiológico fundamental necessário para a saúde celular e do organismo. A desregulação do metabolismo lipídico muitas vezes provoca obesidade e muitas doenças associadas, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes tipo II e câncer. Para avançar no entendimento atual da regulação metabólica lipídica, os métodos quantitativos para medir precisamente os níveis de armazenamento lipídóide in vivo no tempo e no espaço tornaram-se cada vez mais importantes e úteis. As abordagens tradicionais para analisar o armazenamento lipídico são semi-quantitativas para avaliação microscópica ou falta de informações diarrecenciais para medição bioquímica. A microscopia de dispersão Raman estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de rótulos que permite a detecção rápida e quantitativa de lipídios em células vivas com resolução subcelular. Como o contraste é explorado a partir de vibrações moleculares intrínsecas, a microscopia SRS também permite o rastreamento quadridimensional de lipídios em animais vivos. Na última década, a microscopia SRS tem sido amplamente utilizada para imagens de pequenas moléculas em pesquisas biomédicas e superar as principais limitações dos métodos convencionais de coloração fluorescente e extração lipídica. Em laboratório, combinamos microscopia srs com as ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para o poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar a distribuição e heterogeneidade de gotículas lipídicas em diferentes células e tecidos e, finalmente, descobrir novas vias de sinalização conservadas que modulam o metabolismo lipídico. Aqui, apresentamos os princípios de trabalho e a configuração detalhada do microscópio SRS e fornecemos métodos para seu uso na quantificação do armazenamento lipídico em pontos de tempo distintos de desenvolvimento de tipo selvagem e insulina sinalizando mutantes deficientes C. elegans.
Introdução
A obesidade tornou-se um problema de saúde global que ameaça um terço da população em todo o mundo, e apresenta uma séria preocupação médica, dada a sua associação com a saúde mental ruim1 e doenças mortais, incluindo diabetes2, doenças cardiovasculares3 e alguns tipos de câncer4. O estudo do metabolismo lipídico é essencial para entender melhor os problemas biológicos por trás da obesidade. A quantificação rápida e específica do armazenamento lipídico implica a detecção de ácidos graxos e seus derivados, bem como metabólitos contendo esterol, com alta sensibilidade e prefe....
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Protocolo
1. Configuração instrumental para Microscopia de Dispersão Raman Estimulada
NOTA: O sistema de microscopia SRS é construído sobre um laser picosegundo com oscilador óptico integrado de bomba e um microscópio de varredura a laser confocal. O oscilador fornece dois trens de pulso picosegundo, incluindo um feixe de Stokes a 1.064 nm e um feixe de bomba incapaz entre 700-990 nm. A sobreposição temporal e espacial dos dois feixes são alcançadas dentro do laser. Um modulador eletro-óptico embutido (EOM) foi projetado especificamente para microscopia SRS. Este protocolo se concentrará no acoplamento do laser com o microscópio, e no funcionamento diá....
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Resultados
A sinalização de insulina é um importante caminho endócrino que impacta o desenvolvimento, a reprodução, a vida útil e o metabolismo. Em vermes, a sinalização de insulina consiste em cerca de 40 ligantes de peptídeo semelhantes à insulina, ortopal receptor de fator de crescimento semelhante à insulina DAF-2, cascata de quinase PI3K/AKT a jusante, e ortopal do fator de transcrição FoxO, DAF-1620. mutantes daf-2, que não possuem o receptor de insulina, têm mais gotículas lipídicas em seu in.......
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Discussão
Em defesa contra a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados, importantes esforços de pesquisa têm sido implementados para entender melhor os mecanismos regulatórios da homeostase lipídica. Para a detecção quantitativa de moléculas lipídicas em amostras biológicas, a imagem livre de rótulos por microscopia srs tem sido comprovadamente uma alternativa confiável para ensaios bioquímicos e outros métodos de coloração. Nosso grupo e outros revelaram novos mecanismos biológicos na regulação metabólica lipídica, combi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W..), DP1DK113644 (M.C.W.), Fundação March of Dimes (M.C.W.), Fundação Welch (M.C.W.), e por investigador do HHMI (M.C.W.). Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) pelas cepas de C. elegans.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Conversor A/D | Olympus | Unidade | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | Para fazer almofadas de agarose |
| Ferramenta de alinhamento - adaptador | Thorlabs | SM1A4 | Para montar a ferramenta no escopo |
| Ferramenta de alinhamento - alvo | Thorlabs | VRC2SM1 | Para visualização de laser IR |
| Ferramenta de alinhamento - tubo | Thorlabs | SM1L40 | Comprimento pode variar |
| Autocorrelator (Opcional) | APE | pulseCheck | |
| Minicircuitos de filtro passa-banda | BBP-21.4+ se modulado a 20MHz ou KR Electronics 2724 se modulado a 8 MHz | Para sinal com filtragem de frequência de modulação | |
| Cabos | |||
| Microscópio de dissecção | Nikon | SMZ800 | Para manuseio e coleta de sem-fins para imagem |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Utilizado para calibração do sinal SRS |
| Filtro | Chroma Technology | 890/220 CARS | Para remover o feixe de Stokes |
| Fita de rotulagem de laboratório de uso geral | VWR | 89097 | Para fazer almofadas de agarose |
| Lamínulas de vidro | VWR | 48393-106 | Para cobertura de vermes para imagens |
| Lâmina de microscópio de vidro | VWR | 16004-422 | Para fazer almofadas de agarose |
| Microscópio de varredura a laser | Lente Olympus | FV3000 | |
| Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B | Para expansor de feixe | |
| Amplificador de bloqueio | Zurique | HF2LI | |
| Minicircuitos de filtro passa-baixa | BLP-1.9 | Para supressão de ruído da fonte de alimentação | |
| Espelhos | Thorlabs | BB1-E03 | Para relé e periscópio |
| Objetivo | Olympus | UPlanSAPO 20x 0,75, UPlanSAPO 60XW 1,20 | |
| Fotodiodo | Thorlabs | FDS1010 | |
| Fonte de laser de picossegundo | APE | picoEmerald | |
| Fonte de alimentação | TEKPOWER | TP1342U | Para fotodiodo, tensão invertida de 50V |
| Azida de sódio | Sigma | S2002 | Para anestesiar os vermes |
| Apanhador de minhocas | WormStuff | 59-AWP |
Referências
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al.
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Reimpressões e permissões
