JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Published: September 22, 2020
doi:
10.3791/61871
,
1Graduate School of Medicine,Ehime University, 2Proteo-Science Center,Ehime University

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv cellfri metod för produktion av högkvalitativ proteoliposom genom dubbelskiktsdialysmetod med användning av vetecellfritt system och liposomer. Denna metod ger lämpliga medel för funktionell analys av membranproteiner, screening av läkemedelsmål och antikroppsutveckling.

Abstract

Membranproteiner spelar viktiga roller i en mängd olika cellulära processer och utför vitala funktioner. Membranproteiner är medicinskt viktiga vid läkemedelsupptäckt eftersom de är mål för mer än hälften av alla läkemedel. Ett hinder för att genomföra biokemiska, biofysiska och strukturella studier av membranproteiner samt antikroppsutveckling har varit svårigheten att producera stora mängder högkvalitativt membranprotein med korrekt konformation och aktivitet. Här beskriver vi en “dubbelskiktsdialysmetod” med hjälp av ett vetegroddscellsfritt system, liposomer och dialyskoppar för att effektivt syntetisera membranproteiner och förbereda renade proteoliposomer på kort tid med hög framgångsgrad. Membranproteiner kan produceras så mycket som i flera milligram, såsom GPCR, jonkanaler, transportörer och tetraspaniner. Denna cellfria metod bidrar till att minska tid, kostnad och ansträngning för att framställa högkvalitativa proteoliposomer och ger lämpliga medel för funktionell analys av membranproteiner, screening av läkemedelsmål och antikroppsutveckling.

Introduction

Membranproteiner är ett av de viktigaste läkemedelsmålen inom diagnos och terapi. Faktum är att hälften av små sammansatta läkemedel riktar sig till membranproteiner, såsom G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och jonkanaler1. Under åren har forskare arbetat med biokemiska, biofysiska och strukturella studier av membranproteiner för att belysa deras struktur och funktion 2,3. Utveckling av monoklonala antikroppar mot membranproteiner utförs också aktivt för att påskynda funktionella och strukturella studier och för att utveckla terapeutiska och diagnostiska tillämpningar 4,5,6,7,8,9. Alla dessa studier kräver en stor mängd membranproteiner av hög kvalitet10. Till exempel behövs flera milligram renade membranproteiner med naturlig konformation för antikroppsutveckling. En mycket större mängd högrenade membranproteiner krävs för röntgenkristallografi. Massproduktion av membranproteiner är dock fortfarande en flaskhals i membranproteinforskningen11. Membranproteiner har komplicerade strukturer med en eller flera transmembranhelices och spelar viktiga roller i cellhomeostas. Heterolog överuttryck av membranproteiner leder till flera hinder såsom aggregering av membranproteiner som ackumuleras vid höga lokala koncentrationer eller störningar av cellulära signalvägar. Även om uttrycket är framgångsrikt står efterföljande steg i provberedningen också inför svårigheter. Till exempel kräver beredning av proteoliposom hög kompetens och yrkeserfarenhet inom solubilisering, rening och stabilisering av membranproteiner och kostar mycket ansträngning och tid också12,13.

Å andra sidan har viss avancerad teknik dykt upp under de senaste decennierna för att producera proteiner utan användning av levande celler 14,15,16,17,18. Cellfri proteinsyntesteknik rekonstituerar translationsreaktion i ett provrör. Eftersom det inte finns några begränsningar som det cellulära uttryckssystemet har, har cellfria system potential att syntetisera en mängd olika proteiner som är svåra att uttrycka eller visa toxicitet i celler. Renat cellextrakt eller rekonstituerat translationellt maskineri blandas med mall-mRNA, aminosyror och energikällor, och rekombinanta proteiner syntetiseras på kort tid. När det gäller membranproteinsyntesen tillsätts vissa typer av byggnadsställningar som består av lipider eller amfifiler, såsom liposomer, biceller, nanodiscs eller sampolymerer till den cellfria reaktionen 19,20,21,22,23,24. Syntetiserade membranproteiner interagerar med byggnadsställningarna och kan stabiliseras i vatten. Cellfria syntetiserade membranproteiner används i stor utsträckning i funktionella studier och antikroppsproduktion 25,26,27,28,29,30,31.

I detta protokoll beskriver vi en effektiv cellfri metod för proteoliposomproduktion med hjälp av vetecellfritt system och liposomer. Vetecellfritt proteinsyntessystem är ett kraftfullt in vitro-översättningssystem som använder extrakt från vetegroddar 15,32,33. Vetegroddar innehåller en stor mängd translationella maskiner och få översättningshämmare. Translationsmaskineriet i vete, en medlem av eukaryoter, är lämpligt för översättning av eukaryota proteiner, och dess översättningseffektivitet påverkas knappast av kodonanvändning av mallen mRNA. Med hjälp av vetecellfritt system har vi syntetiserat en mängd olika proteiner inklusive proteinkinaser 34,35, ubiquitinligaser36, transkriptionsfaktorer37 och membranproteiner med höga framgångsgrader. För membranproteinproduktion tillsätter vi lipidvesikelliposom i översättningsblandningen som ställning19,38. Hydrofoba domäner av membranprotein interagerar med lipid-dubbelskikt och är spontant integrerade med liposom. Densitetsgradientcentrifugering används för att strikt separera proteoliposom från endogena veteproteiner, även om en gemensam centrifugering av translationsreaktionsblandningen är tillräcklig för en enkel rening av proteoliposom20. Många typer av integrerade membranproteiner har syntetiserats med hjälp av vetecellfritt system och tillämpats för olika undersökningar och utvecklingar 25,38,39,40,41,42,43,44. Dessutom utvecklade vi “dubbelskiktsdialysmetoden” för storskalig produktion45,46. I denna metod nedsänks dialysanordningen av kopptyp i substratmatningsbufferten och två lager av translationsreaktionsblandning och substratmatningsbuffert bildas i koppen som visas i figur 1. Kontinuerlig tillförsel av substrat och avlägsnande av biprodukten kan effektivt utföras på både toppen och botten av reaktionsblandningen under lång tid, vilket leder till utmärkt översättningseffekt (figur 2A och figur 2B)45.

Protocol

1. Beredning av pEU-uttrycksplasmid OBS: pEU-uttrycksplasmid bör inkludera startkodon, öppen läsram för målmembranprotein och stoppkodon i fragmentet (se figur 1). Lägg till sekvens(er) av detekterings-/reningstaggar på lämplig plats vid behov. Antingen restriktionsenzymsmältning eller sömlös kloning är tillämplig för subkloning. Här beskriver vi ett protokoll med en sömlös kloningsmetod. Förbered sätt in DNA-fragment.Förstär…

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll kan delvis renade proteoliposomer erhållas på kort tid. Representativa resultat visas i figur 2A. Tjugofem GPCR av klass A, B och C syntetiserades framgångsrikt med hjälp av dubbelskiktsdialysmetoden (liten skala) och renades delvis genom centrifugering och bufferttvätt. Även om mängden syntetiserade proteiner varierar beroende på typen av protein, kan 50 till 400 μg membranproteiner vanligtvis syntetiseras per reaktion när stora dialyskoppar används….

Discussion

Det presenterade protokollet ger en metod för att producera membranproteiner med hög framgångsgrad. Detta protokoll är enkelt, mycket reproducerbart och lätt att skala upp. Det har också potential att minska tiden och kostnaden för experiment som konsumerar en stor mängd membranproteiner. Dubbelskiktsdialysmetoden förbättrar produktiviteten med 4–10 gånger jämfört med tvåskiktsmetoden eller dialysmetoden (figur 2B)45. I ett extremt fall ökade utbytet …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) från AMED under bidragsnummer JP20am0101077. Detta arbete stöddes också delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

Materials

×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Tags

Cell-free ProductionProteoliposomesMembrane ProteinsDrug DiscoveryIn-vitro Protein SynthesisLiposome PreparationWheat Germ ExtractTranscriptionTranslationCell-free Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image