Summary

Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels

Published: October 23, 2021
doi:

Summary

Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Abstract

De theorie van een “steriel” vrouwelijk bovenste voortplantingskanaal stuit op toenemende weerstand als gevolg van vooruitgang in bacteriële detectie. Of eierstokken bacteriën bevatten, is echter nog niet bevestigd. Hierin werd een experiment geïntroduceerd om bacteriën in eierstokweefsels te detecteren. We kozen eierstokkankerpatiënten in de kankergroep en niet-kankerachtige patiënten in de controlegroep. 16S rRNA-gensequencing werd gebruikt om bacteriën in eierstokweefsels te onderscheiden van de kanker- en controlegroepen. Verder voorspelden we de functionele samenstelling van de geïdentificeerde bacteriën met behulp van BugBase en PICRUSt. Deze methode kan ook worden gebruikt in andere ingewanden en weefsels, omdat de afgelopen jaren is bewezen dat veel organen bacteriën herbergen. De aanwezigheid van bacteriën in ingewanden en weefsels kan wetenschappers helpen bij het evalueren van kankerachtige en normale weefsels en kan helpen bij de behandeling van kanker.

Introduction

Onlangs zijn er steeds meer artikelen gepubliceerd die het bestaan van bacteriën in abdominale vaste ingewanden bewijzen, zoals de nier, milt, lever en eierstok1,2. Geller et al. vonden bacteriën in pancreastumoren en deze bacteriën waren resistent tegen gemcitabine, een chemotherapeutisch medicijn2. S. Manfredo Vieira et al. concludeerden dat Enterococcus gallinarum draagbaar was naar de lymfeklieren, lever en milt, en het kon auto-immuniteitstimuleren 3.

Omdat de baarmoederhals een rol speelt als verdediger, zijn bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal, dat de baarmoeder, eileiders en eierstokken bevat, minimaal onderzocht. De laatste jaren zijn er echter enkele nieuwe theorieën gevestigd. Bacteriën kunnen toegang hebben tot de baarmoederholte tijdens de menstruatiecyclus als gevolg van veranderingen in mucines4,5. Bovendien bevestigden Zervomanolakis et al. dat de baarmoeder, samen met de eileiders, een peristaltische pomp is die wordt bestuurd door het endocriene systeem van de eierstokken, en deze opstelling stelt bacteriën in staat om het baarmoederslijmvlies, de eileiders en de eierstokken binnen te dringen6.

Het bovenste voortplantingskanaal is niet langer een mysterie meer dankzij de ontwikkeling van bacteriële detectiemethoden. Verstraelen et al. gebruikten een barcoded paired-end sequencing methode om baarmoederbacteriën te ontdekken door zich te richten op het V1-2 hypervariabele gebied van het 16S RNA gen7. Fang et al. gebruikten barcode-sequencing bij patiënten met endometriumpoliepen en onthulden de aanwezigheid van diverse intra-uteriene bacteriën8. Bovendien vonden Miles et al. en Chen et al. door het 16S RNA-gen te gebruiken bacteriën in het genitale systeem van vrouwen die salpingo-oöforectomie en hysterectomie hadden ondergaan, respectievelijk5,9.

Bacteriën in tumorweefsels hebben de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen. Banerjee et al. ontdekten dat de microbioomsignatuur verschilde tussen eierstokkankerpatiënten en controles10. Eennoxynatronum sibiricum was geassocieerd met tumorstadium en Methanosarcina vacuolata kan worden gebruikt om eierstokkanker te diagnosticeren11. Naast eierstokkanker is bewezen dat andere kankers, zoals maag-, long-, prostaat-, borst-, baarmoederhals- en baarmoederslijmvlies, geassocieerd zijn met bacteriën12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. stelden een nieuwe klasse van microbiële oncologische diagnostiek voor, met een vroeg stadium van kankerscreening19. In dit protocol onderzochten we de verschillen tussen kankerachtige en normale eierstokweefsels door de samenstelling en functie van bacteriën in deze twee weefsels te vergelijken.

Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-gensequencing werden uitgevoerd om de aanwezigheid van bacteriën in de eierstokken te bevestigen. De verschillen en voorspelde functies van de eierstokbacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels werden bestudeerd. De resultaten toonden het bestaan van bacteriën in eierstokweefsels. Anoxynatronum sibiricum pt Methanosarcina vacuolata waren gerelateerd aan respectievelijk het stadium en de diagnose van eierstokkanker. Zesenveertig significant verschillende KEGG-routes die in beide groepen aanwezig waren, werden vergeleken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Medisch Institutionele Ethische Commissie van het Eerste Aangesloten Ziekenhuis van Xi’an Jiaotong University (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle ingeschreven patiënten. 1. Criteria voor het invoeren van de kankergroep en de controlegroep Voor de kankergroep, inschrijven patiënten die voornamelijk worden gediagnosticeerd met eierstokkanker, en na laparotomie is bewezen dat ze sereuze eier…

Representative Results

PatiëntenIn totaal werden 16 gekwalificeerde patiënten geïncludeerd in de studie. De controlegroep omvatte 10 vrouwen met een diagnose van goedaardige baarmoedertumor (onder hen werden 3 patiënten gediagnosticeerd met baarmoeder myoma en 7 patiënten werden gediagnosticeerd met baarmoederadenoom). Ondertussen bevatte de kankergroep 6 vrouwen met een diagnose van sereuze eierstokkanker (onder hen werden 2 patiënten gediagnosticeerd met stadium II en 2 van hen werden gediagnosticeerd met stadium I…

Discussion

Eierstokkanker heeft een opmerkelijke invloed op de vruchtbaarheid van vrouwen25. De meeste patiënten met eierstokkanker worden in een laat stadium gediagnosticeerd en de 5-jaarsoverleving is minder dan 30%18. Bevestiging van bacteriën in de abdominale vaste ingewanden, waaronder de lever, pancreas en milt, is gepubliceerd. Het bestaan van bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal treedt op omdat de baarmoederhals niet is ingesloten2,</…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Clinical Research Award van het First Affiliated Hospital van Xi’an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), het Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), het Key Research and Development Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), het Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002), en het medisch onderzoeksproject van Xi’an Social Development Guidance Plan (2017117SF /YX011-3). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

We bedanken de collega’s van de afdeling Gynaecologie van het First Affiliated Hospital van de Xi’an Jiaotong University voor hun bijdragen aan het verzamelen van monsters.

Materials

2200 TapeStation Software Agilgent
United States
AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories Illumina
Image-pro plus 7 Media Cybernetics
Leica ASP 300S Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica EG 1150 Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica RM2235 Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads Omega Biotek M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit Omega Biotek M4029-01
MiSeq Illumina SY-410-1003
Silva database Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University
the QuantiFluor dsDNA System Promega E2670
Trimmomatic Björn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit Zytomed Systems HRP008DAB-RB

Referências

  1. Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
  2. Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
  3. Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
  4. Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
  5. Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
  6. Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
  7. Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
  8. Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
  9. Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
  10. Banerjee, S., et al. The ovarian cancer oncobiome. Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).
  11. Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
  12. Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
  13. Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
  14. Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
  15. Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
  16. Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
  17. Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
  18. Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
  19. Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
  20. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  21. Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
  22. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  23. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
  24. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
  25. Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
check_url/pt/61878?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Zhao, L., Zhao, W., Wang, Q., Liang, D., Liu, Y., Fu, G., Han, L., Wang, Y., Sun, C., Wang, Q., Song, Q., Li, Q., Lu, Q. Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues. J. Vis. Exp. (176), e61878, doi:10.3791/61878 (2021).

View Video