Karakterisering og funksjonell prediksjon av bakterier i eggstokkvev
Summary
Immunhiistokjemi farging og 16S ribosomal RNA gen (16S rRNA gen) sekvensering ble utført for å oppdage og skille bakterier i kreft og ikke-kreftholdig eggstokkvev in situ. De sammensetningsmessige og funksjonelle forskjellene i bakteriene ble spådd ved å bruke BugBase og Phylogenetic Investigation of Communities ved rekonstruksjon av uobserverte stater (PICRUSt).
Abstract
Teorien om en “steril” kvinnelig øvre reproduktive kanal har møtt økende motstand på grunn av fremskritt innen bakteriedeteksjon. Hvorvidt eggstokkene inneholder bakterier er imidlertid ennå ikke bekreftet. Heri ble et eksperiment for å oppdage bakterier i eggstokkvev introdusert. Vi valgte eggstokkkreftpasienter i kreftgruppen og ikke-kreftpasienter i kontrollgruppen. 16S rRNA gensekvensering ble brukt til å skille bakterier i eggstokkvev fra kreft- og kontrollgruppene. Videre forutsa vi den funksjonelle sammensetningen av de identifiserte bakteriene ved hjelp av BugBase og PICRUSt. Denne metoden kan også brukes i andre viscera og vev siden mange organer har vist seg å huse bakterier de siste årene. Tilstedeværelsen av bakterier i viscera og vev kan hjelpe forskere med å evaluere kreft og normalt vev og kan være til hjelp i behandlingen av kreft.
Introduction
Nylig har et økende antall artikler blitt publisert som beviser eksistensen av bakterier i abdominal solid viscera, som nyre, milt, lever og eggstokk1,2. Geller et al. fant bakterier i bukspyttkjertelsvulster, og disse bakteriene var resistente mot gemcitabine, et kjemoterapeutisk legemiddel2. S. Manfredo Vieira et al. konkluderte med at Enterococcus gallinarum var bærbart for lymfeknuter, lever og milt, og det kunne drive autoimmunitet3.
Siden livmorhalsen spiller en rolle som forsvarer, har bakterier i øvre kvinnelige reproduktive kanal, som inneholder livmor, egglederne og eggstokkene, blitt minimalt forsket på. Det er imidlertid etablert noen nye teorier de siste årene. Bakterier kan ha tilgang til livmorhulen under menstruasjonssyklusen på grunn av endringer i mucins4,5. I tillegg bekreftet Zervomanolakis et al. at livmoren, sammen med egglederne, er en peristaltisk pumpe kontrollert av eggstokkenes endokrine system, og dette arrangementet gjør det mulig for bakterier å komme inn i endometrium, egglederne og eggstokkene6.
Den øvre reproduktive kanalen er ikke lenger et mysterium takket være utviklingen av bakterielle deteksjonsmetoder. Verstraelen et al. brukte en strekkodet paired-end sekvenseringsmetode for å oppdage livmorbakterier ved å målrette mot V1-2 hypervariabel region i 16S RNA-genet7. Fang et al. ansatt strekkodet sekvensering hos pasienter med endometrial polypper og avslørte tilstedeværelsen av ulike intrauterin bakterier8. I tillegg, ved å bruke 16S RNA-genet, fant Miles et al. og Chen et al. bakterier i kjønnssystemet til kvinner som hadde gjennomgått salpingo-oophorectomy og hysterektomi, henholdsvis5,9.
Bakterier i tumorvev har fått økende oppmerksomhet de siste årene. Banerjee et al. oppdaget at mikrobiomesignaturen var forskjellig mellom eggstokkkreftpasienter og kontroller10. Etnoxynatronum sibiricum var forbundet med tumorstadium, og Methanosarcina vacuolata kan brukes til å diagnostisere eggstokkkreft11. I tillegg til eggstokkkreft har andre kreftformer, som mage, lunge, prostata, bryst, livmorhals og endometrium, vist seg å være forbundet med bakterier12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. foreslo en ny klasse mikrobiell basert onkologidiagnostikk, forutså tidlig kreftscreening19. I denne protokollen undersøkte vi forskjellene mellom kreft og normalt eggstokkvev ved å sammenligne sammensetningen og funksjonen til bakterier i disse to vevene.
Immunhiistokjemi farging og 16S rRNA gensekvensering ble utført for å bekrefte tilstedeværelsen av bakterier i eggstokkene. Forskjellene og predikerte funksjonene til eggstokkbakteriene i kreft og ikke-kreftvev ble studert. Resultatene viste eksistensen av bakterier i eggstokkvev. Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata var relatert til henholdsvis scenen og diagnosen eggstokkkreft. Førtiseks signifikant forskjellige KEGG-veier som var til stede i begge gruppene ble sammenlignet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovariekreft har en bemerkelsesverdig innflytelse på kvinners fruktbarhet25. De fleste eggstokkkreftpasienter diagnostiseres på sene stadier, og 5-års overlevelsesrate er mindre enn 30%18. Bekreftelse av bakterier i abdominal solid viscera, inkludert leveren, bukspyttkjertelen og milten, har blitt publisert. Eksistensen av bakterier i øvre kvinnelige reproduktive kanal oppstår fordi livmorhalsen ikke er vedlagt2,3</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Clinical Research Award of the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), det viktigste forsknings- og utviklingsprosjektet til Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) og Det medisinske forskningsprosjektet til Xi’an Social Development Guidance Plan (2017117SF/YX011-3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Vi takker kollegene ved Institutt for gynekologi ved First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University for deres bidrag til å samle inn prøver.
Materials
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
Referências
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al. The ovarian cancer oncobiome. Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
