Характеристика и функциональное прогнозирование бактерий в тканях яичников
Summary
Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование гена рибосомальной РНК 16S (ген 16S рРНК) были выполнены с целью обнаружения и различения бактерий в раковых и нераковых тканях яичников in situ. Композиционные и функциональные различия бактерий были предсказаны с помощью BugBase и филогенетического исследования сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний (PICRUSt).
Abstract
Теория «стерильного» женского верхнего репродуктивного тракта сталкивается с растущей оппозицией из-за достижений в обнаружении бактерий. Однако, содержат ли яичники бактерии, пока не подтверждено. Здесь был проведен эксперимент по обнаружению бактерий в тканях яичников. Мы выбрали пациентов с раком яичников в группе рака и нераковых пациентов в контрольной группе. Секвенирование гена 16S рРНК использовалось для дифференциации бактерий в тканях яичников от онкологической и контрольной групп. Кроме того, мы предсказали функциональный состав идентифицированных бактерий с помощью BugBase и PICRUSt. Этот метод также может быть использован в других внутренних органах и тканях, поскольку в последние годы было доказано, что многие органы содержат бактерии. Присутствие бактерий во внутренних путях и тканях может помочь ученым оценить раковые и нормальные ткани и может помочь в лечении рака.
Introduction
В последнее время публикуется все большее количество статей, доказывающих существование бактерий в брюшных твердых внутренних путях, таких как почки, селезенка, печень,яичник 1,2. Geller et al. обнаружили бактерии в опухолях поджелудочной железы, и эти бактерии были устойчивы к гемцитабину, химиотерапевтическому препарату2. S. Manfredo Vieira et al. пришли к выводу, что Enterococcus gallinarum переносится в лимфатические узлы, печень и селезенку, и он может управлять аутоиммунитетом3.
Поскольку шейка матки играет роль защитника, бактерии в верхнем женском репродуктивном тракте, который содержит матку, фаллопиевы трубы и яичники, были минимально исследованы. Тем не менее, в последние годы были созданы некоторые новые теории. Бактерии могут иметь доступ к полости матки во время менструального цикла из-за изменений в муцинах4,5. Кроме того, Zervomanolakis et al. подтвердили, что матка вместе с фаллопиевыми трубами представляет собой перистальтический насос, контролируемый эндокринной системой яичников, и это расположение позволяет бактериям проникать в эндометрий, фаллопиевы трубы и яичники6.
Верхний репродуктивный тракт больше не является загадкой благодаря развитию методов обнаружения бактерий. Verstraelen et al. использовали метод штрих-кодированного парного секвенирования для обнаружения матчных бактерий путем нацеливания на гипервариабельную область V1-2 гена 16S РНК7. Fang et al. использовали штрих-кодирование секвенирования у пациенток с полипами эндометрия и выявили наличие разнообразных внутриматочных бактерий8. Кроме того, используя ген РНК 16S, Miles et al. и Chen et al. обнаружили бактерии в половой системе женщин, перенесших сальпингоофорэктомию и гистерэктомию соответственно5,9.
Бактерии в опухолевых тканях получили все большее внимание в последние годы. Banerjee et al. обнаружили, что сигнатура микробиома различается между пациентами с раком яичников и контрольной10. Noxynatronum sibiricum был связан со стадией опухоли, а Methanosarcina vacuolata может быть использована для диагностики рака яичников11. В дополнение краку яичников, было доказано, что другие виды рака, такие как рак желудка, легких, предстательной железы, молочной железы, шейки матки и эндометрия, связаны с бактериями12,13,14, 15,16,17,18. Poore et al. предложили новый класс онкологической диагностики на основе микробов, предвидя скрининг рака на ранней стадии19. В этом протоколе мы исследовали различия между раковыми и нормальными тканями яичников, сравнивая состав и функцию бактерий в этих двух тканях.
Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование гена 16S рРНК были выполнены для подтверждения присутствия бактерий в яичниках. Изучены различия и прогнозируемые функции бактерий яичников в раковых и нераковых тканях яичников. Результаты показали существование бактерий в тканях яичников. Anoxynatronum sibiricum и Methanosarcina vacuolata были связаны со стадией и диагнозом рака яичников соответственно. Сравнивалось сорок шесть значительно отличавшихся путей KEGG, которые присутствовали в обеих группах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рак яичников оказывает заметное влияние на фертильность женщин25. Большинство пациенток с раком яичников диагностируются на поздних стадиях, а 5-летняя выживаемость составляет менее 30%18. Опубликовано подтверждение бактерий в брюшных твердых внутренностей, вк?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана премией за клинические исследования Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун, Китай (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Крупным проектом фундаментальных исследований естественных наук Департамента науки и техники провинции Шэньси (2018JM7073, 2017ZDJC-11), Ключевым проектом исследований и разработок Департамента науки и техники провинции Шэньси (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Проектом совместных технологических инноваций провинции Шэньси (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Проектом совместных технологических инноваций провинции Шэньси (2 017XT-026, 2018XT-002) и Проект медицинских исследований Плана руководства по социальному развитию Сианя (2017117SF/YX011-3). Спонсоры не имели никакого значения в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Мы благодарим коллег из отделения гинекологии Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун за их вклад в сбор образцов.
Materials
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
Referências
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al. The ovarian cancer oncobiome. Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
