Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.
El tejido adiposo visceral (VAT) es un órgano metabólico activo compuesto principalmente por adipocitos maduros y células de la fracción vascular estromal (SVF), que liberan diferentes moléculas bioactivas que controlan los procesos metabólicos, hormonales e inmunológicos; Actualmente, no está claro cómo se regulan estos procesos dentro del tejido adiposo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos que evalúen la contribución de cada población celular a la fisiopatología del tejido adiposo es crucial. Este protocolo describe los pasos de aislamiento y proporciona las pautas de resolución de problemas necesarias para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa. Además, el protocolo también está optimizado para identificar subconjuntos de macrófagos y realizar el aislamiento de ARN de adipocitos maduros para estudios de expresión génica, lo que permite realizar estudios de disección de la interacción entre estas poblaciones celulares. Brevemente, las biopsias de VAT se lavan, se pican mecánicamente y se digieren para generar una suspensión unicelular. Después de la centrifugación, los adipocitos maduros se aíslan por flotación del gránulo de SVF. El protocolo de extracción de ARN garantiza un alto rendimiento de ARN total (incluidos los miARN) de los adipocitos para los ensayos de expresión posteriores. Al mismo tiempo, las células SVF se utilizan para caracterizar subconjuntos de macrófagos (fenotipo proinflamatorio y antiinflamatorio) mediante análisis de citometría de flujo.
El tejido adiposo blanco está compuesto no solo por células grasas o adipocitos, sino también por una fracción de células no grasas conocida como fracción vascular estromal (SVF), que contiene una población celular heterogénea formada por macrófagos, otras células inmunitarias como células T reguladoras (Tregs) y eosinófilos, preadipocitos y fibroblastos, rodeados de tejido vascular y conectivo 1,2. El tejido adiposo (TA) es considerado actualmente un órgano que regula los procesos fisiológicos relacionados con el metabolismo y la inflamación a través de adipoquinas, citocinas y microRNAs producidos y liberados por diferentes células en el tejido, con efectos autocrinos, paracrinos y endocrinos 3,4. En el ser humano, el tejido adiposo blanco comprende el tejido adiposo subcutáneo (SAT) y el tejido adiposo visceral (VAT), con importantes diferencias anatómicas, moleculares, celulares y fisiológicas entre ellos 2,5. El SAT representa hasta el 80% de la TA humana, mientras que el VAT se localiza dentro de la cavidad abdominal, principalmente en el mesenterio y el epiplón, siendo metabólicamente más activo6. Además, el VAT es un órgano endocrino que secreta mediadores con un impacto sustancial en el peso corporal, la sensibilidad a la insulina, el metabolismo de los lípidos y la inflamación. En consecuencia, la acumulación de IVA conduce a la obesidad abdominal y a enfermedades relacionadas con la obesidad como la diabetes tipo 2, el síndrome metabólico, la hipertensión y el riesgo de enfermedades cardiovasculares, lo que representa un mejor predictor de mortalidad asociada a la obesidad 6,7,8,9.
En condiciones homeostáticas, los adipocitos, macrófagos y otras células inmunitarias cooperan para mantener el metabolismo del VAT a través de la secreción de mediadores antiinflamatorios10. Sin embargo, la expansión excesiva del VAT promueve el reclutamiento de células T activadas, células NK y macrófagos. De hecho, en el VAT magro, la proporción de macrófagos es del 5%, mientras que esta proporción se eleva hasta el 50% en la obesidad, con polarización de macrófagos de fenotipo antiinflamatorio a proinflamatorio, generando un ambiente inflamatorio crónico10,11.
Como consecuencia de la pandemia de obesidad, han surgido una cantidad asombrosa de reportes que abordan diferentes temas de investigación del IVA, incluyendo la biología de los adipocitos, la epigenética, la inflamación, las propiedades endocrinas y las áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre otros 8,10,12,13. Sin embargo, a pesar de que el ambiente VAT está definido por la diafonía entre los adipocitos y los macrófagos residentes o entrantes, la mayoría de los estudios se han centrado en una sola población celular, y existe escasa información sobre la interacción de estas células en el VAT y sus consecuencias fisiopatológicas11,14. Además, se realizaron valiosos estudios que abordaron la interacción adipocito-macrófago en la TA utilizando líneas celulares que carecían de las condiciones de cebado in vivo 11,14,15. Una estrategia adecuada para diseccionar la interacción o la contribución particular de estas células en el VAT requiere el aislamiento de ambos tipos celulares a partir de la misma biopsia de grasa para realizar ensayos in vitro que reflejen lo más similares posible las propiedades in vivo que regulan el metabolismo del VAT.
A pesar de que los métodos de disociación no enzimática basados en fuerzas mecánicas para romper la TA aseguran una mínima manipulación, estos métodos no pueden ser utilizados si el objetivo es estudiar las células SVF, ya que tienen menor eficiencia en la recuperación celular y baja viabilidad celular en comparación con los métodos enzimáticos, y se necesita un mayor volumen de tejido16,17. La digestión enzimática mediante colagenasa es un método suave que permite una digestión adecuada del colágeno y de las proteínas de la matriz extracelular de los tejidos fibrosos como WAT18 y se utiliza con frecuencia cuando la tripsina es ineficaz o dañina19. El protocolo proporciona pautas fundamentales de resolución de problemas para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y células SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa, que brinda información para garantizar altos rendimientos (cantidad, pureza e integridad) de ARN total de adipocitos maduros, incluidos microARN, para aplicaciones de expresión posteriores. Al mismo tiempo, el protocolo se optimiza para identificar subconjuntos de macrófagos de células SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su posterior análisis mediante citometría de flujo20.
El IVA juega un papel crucial en la regulación metabólica y la inflamación. El creciente interés en el papel de los adipocitos y las células inmunitarias en la inflamación crónica asociada a la obesidad ha llevado al desarrollo de diferentes técnicas para separar la FVS y las células grasas presentes en la TA. Sin embargo, la mayoría de las técnicas no permiten obtener estos dos conjuntos diferentes de células viables para aplicaciones posteriores a partir de la misma biopsia de VAT en un solo procedimiento, …
The authors have nothing to disclose.
Este estudio contó con el apoyo del Instituto Nacional de Perinatología (números de subvención: 3300-11402-01-575-17 y 212250-3210-21002-06-15) y CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (subvención número 2015-3-2-61661).
0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | – |
2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | – |
Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | – |
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
Baker | – | – | 250 ml, non sterile |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | – |
Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
Dissecting forceps | – | – | Steel, serrated jaws and round ends |
Dissection tray | – | – | Stainless steel |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | – |
FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | – |
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | – |
FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | – |
Manual cell counter | – | – | – |
Mayo dissecting scisors | – | – | Stainless steel |
Microcentrifuge | – | – | Adjustable temperature |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | – |
Orbital shaker | – | – | Adjustable temperature and speed |
P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | – |
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
Pipette controller | – | – | – |
Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
Refrigerated centrifuge | – | – | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
Sterile Specimen container | – | – | – |
Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
Tube racks | – | – | For different tube sizes |
Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | – |