in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델
Summary
면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.
Abstract
복잡한 질병 모델에는 생리학적, 병리학적으로 관련성이 있고 실행 가능한 통찰력을 제공하고 다른 방법으로는 보이지 않는 프로세스를 공개할 수 있는 최첨단 도구가 필요합니다. 생체 내 풍경을 밀접하게 모방한 고급 세포 분석은 암의 진행에 영향을 미치는 양방향 종양-숙주 상호작용을 시각화하고 측정하는 새로운 방법으로 자리 잡고 있습니다. 여기에서는 자연 및 치료 유발 면역 감시 하에서 종양 미세 환경(TME)의 복잡성을 모방하여 마이크로 장치에서 고도로 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 재현하는 두 가지 다목적 프로토콜에 대해 설명합니다. 섹션 1에서는 명시야 타임랩스 현미경으로 부착 종양 세포와 부유 면역 집단 간의 누화를 모니터링하기 위한 실험 설정이 제공됩니다. 적용 시나리오로서, 우리는 면역 세포의 모집 및 활성화에 대한 소위 면역 원성 암세포 사멸 유도제와 같은 항암 치료의 효과를 분석합니다. 섹션 2에서는 3D 종양 면역 미세 환경이 경쟁력 있는 레이아웃으로 조립됩니다. 차등 면역 침윤은 최대 72시간의 형광 스냅샷으로 모니터링되어 병용 치료 전략을 평가합니다. 두 설정 모두에서, 과다한 면역 세포 파라미터(예를 들어, 면역 세포 이동 및 상호작용, 치료제에 대한 반응)를 추출하기 위한 이미지 처리 단계가 예시된다. 이러한 간단하고 강력한 방법은 암, 기질 및 면역 세포 아형의 이질성과 가소성뿐만 아니라 암 진화의 동인으로서의 상호 상호 작용을 포함하는 TME의 복잡성을 시뮬레이션하기 위해 추가로 맞춤화될 수 있습니다. 빠르게 진화하는 기술을 라이브 셀 고함량 이미징과 함께 사용하면 대규모 정보 데이터 세트가 생성되어 새로운 문제가 발생할 수 있습니다. 실제로 삼각형 ”공동 배양/현미경/고급 데이터 분석’은 맞춤형 치료 프로토콜을 지원할 수 있는 정확한 문제 매개변수화를 향한 경로를 설정합니다. 우리는 고처리량 처리를 위한 인공 지능과 암 면역 온어칩의 향후 통합이 정밀 및 개인화된 종양학을 위한 예측 및 전임상 도구로서의 기능을 활용하는 데 있어 큰 진전을 이룰 것으로 기대합니다.
Introduction
실험 분야로서의 다양한 의학 분야의 진화는 통제된 조건 하에서 세포 집단과 장기 기능을 조작하는 능력에 달려 있다1. 이러한 능력은 우리 몸에서 일어나는 과정을 요약할 수 있는 측정 가능한 모델의 가용성에 뿌리를 두고 있습니다.
면역요법 및 단세포 게놈 프로파일링 2의 시대에, 암 생물학은 적절한 시공간적 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위해 새로운 시험관 내 및 전산 모델을 활용해야 합니다 2,3.
종양미세환경4(TME)는 암세포가 다른 세포(면역, 기질 및 내피 세포) 및 비세포(세포외 기질, ECM) 구성 요소와 지속적으로 상호 작용하고 동적으로 공동 진화하는 복잡한 조직입니다. 이 복잡한 환경의 역동적인 특성은 면역 세포가 악성 세포의 친구 역할을 하는지 아니면 적으로 작용하는지 여부를 결정하여 질병 진행과 치료에 대한 반응 모두에 큰 영향을 미칩니다. 오늘날, 종양 면역학자, 생물 정보학자 및 시스템 생물학 전문가들의 많은 노력이 공간(즉, 뚜렷한 종양 영역)과 시간(즉, 뚜렷한 종양 진행 단계)5,6에서 암 이질성5,6의 임상적 중요성을 다루고, 단일 세포 수준에서 암과 면역 세포 표현형과 기능을 특성화하기 위해 수렴되고 있습니다. 이러한 시너지 효과의 예로서, 진보된 컴퓨터 비전 기술은 이제 조직학적 샘플에서 면역 침윤물의 공간 매핑을 위해 일상적으로 사용된다 7,8.
실험 모델의 전면에서 동물 연구와 전통적인 체외 방법을 연결하는 미세 유체 공학 및 공동 배양 기술의 발전은 오가노이드, 미세 생리학적 시스템 9,10,11(MPS) 및 장기 칩12,13,14과 같은 다양한 종류의 미세 공학 세포 모델에 대한 액세스를 제공합니다 (OOC)입니다. 이들은 세포 생태계에 대한 ‘큰 그림’을 확대하고 미시 환경 요인을 제어하기 위해 체외 잠재력을 확장하는 동시에 고함량 현미경15 및 이미지 처리 접근 방식을 활용하는 공통된 특성을 공유합니다.
오늘날 최첨단 MPS 및 OOC 시스템은 염증성 질환, 상처 치유, 점막 면역, 독소 또는 일상 식품에 대한 반응과 같은 다양한 과정을 탐색하고 측정하기 위해 기존 조직 및 공동 배양에 다양한 면역 세포 하위 유형을 통합하는 면역학적 측면을 포함하기 시작했습니다16. TME-on-a-chip 모델 10,11,12,13,14,15,16,17은 또한 관류 가능한 미세 혈관 18,19,20,21과 통합되어 세포 유형 의존적 상호 작용, 물리적 및 화학적 섭동 및 세포 독성 활성을 조사하기 위해 개발되었습니다. 침윤성 림프구22 및 임상적으로 관련된 면역조절제23.
여기에서는 칩에 세포를 로딩하는 것부터 이미지 처리 도구에 이르기까지 다양한 프로토콜을 제공하여 2D(섹션 1) 및 3D(섹션 2) 설정(16)에서 고급 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하며, 동적 다중 매개변수24 모니터링 및 세포 기능 시각화와 호환됩니다. 이는 샘플 관리 및 데이터 분석 모두에서 사용 용이성과 유연성을 유지하여 피지 프리웨어 소프트웨어와 해당 도구 상자25,26을 활용하여 달성됩니다.
섹션 1에 설명된 미세유체 장치는 부착성 암과 부유 면역 세포의 2D 공동 배양을 수행하도록 설계되었습니다. 이 플랫폼은 유전적 돌연변이27 및/ 또는 면역 결핍28의 존재 하에서 면역 세포 행동의 시험관 내 측정을 위해 검증되었다. 여기에서는 Trackmate(피지 소프트웨어에 구현된 플러그인)를 기반으로 하는 반자동 방법을 활용하여 타임랩스 명시야 이미지에서 면역 세포를 추적하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 면역원성 세포 사멸 유도제( 27 )로 치료되거나 치료되지 않은 표적 암세포에 대한 면역 이동(29) 및 반응(즉, 상호작용 시간)의 운동학적 설명자의 추출을 가능하게 한다.
중요한 것은 시계열 이미지에서 추출된 이러한 매개변수가 고급 수학 기계로 처리될 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 잠재력에 대한 예로서, 우리 그룹은 최근 확률 론적 과정과 통계 역학의 수학적 방법을 기반으로 한 분석을 발표하여 세포 네트워크 속성을 모델링하고 면역 세포 행동에 대한 매개 변수화 된 설명을 제공합니다 (즉, 편향되거나 상관 관계가 없는 랜덤 워크, 고도로 조정되거나 조정되지 않은 움직임30,31).
두 번째 섹션에서 제공되는 3D 설정은 공동 배양 프로토콜을 기반으로 하여 서로 다른 세포 유형과 약물 조합을 사용하여 두 개의 겔 영역에 내장된 보다 복잡한 면역 적격 TME를 경쟁력 있는 방식으로 재현합니다. 여기서, 이미지 처리 단계는, 상이한 시점에서, 마트리겔 내에서 배양된 인간 A375M 흑색종 세포에서 염색된 면역 세포의 침윤을 측정하여, 항종양제 조합을 평가하기 위한 것이다32. A375M 계통은, 고도의 전이성 표현형을 특징으로 하는 A375P 유래 세포주를 면역세포의 존재 하에서 이들의 전이능을 평가하기 위해 선택하였다32.
기술된 모델은 상이한 세포 공급원(쥐 및 인간 불멸화 또는 1차 세포주, 오가노이드, 이종이식 등)과 완전히 호환될 수 있다. 우리 연구실의 최근 연구에서, 고함량 비디오 현미경과 이미지 분석을 결합하여, 경쟁력 있는 3D 레이아웃을 적용하여 조사하였다: i) 항종양성(항체 의존성 세포 매개 세포독성, ADCC) 면역 반응 및 HER2+ 유방암 온칩 모델33에서 트라스투주맙 요법에 대한 내성에서 섬유아세포의 역할 해부; ii) 종양 회피 및 T 세포 모집 메커니즘에서 골수 세포(즉, 암 관련 대식세포)의 작용34; iii) 콜라겐 매트릭스에서 약물 처리된 결장암 세포로 배양된 인터페론-α 조절 수지상 세포(IFN-DC)를 기반으로 하는 면역요법 요법의 효능 및 효율적인 운동 및 후속 식균 작용 사건을 평가하기 위한35; iv) 골수 유래 호산구의 IL-33 처리 또는 처리되지 않은 흑색종 세포로의 화학주성 이동36.
이러한 고급 모델은 암 전이 및 내성 메커니즘에서 면역 조직 구성의 역할을 이해하기 위한 관찰 창 역할을 할 수 있지만, 연구 결과를 임상으로 변환하여 기초 연구와의 격차를 좁히기 위한 노력이 필요합니다37.
새로운 시나리오로서, 보다 생리학적으로 관련성이 높은 마이크로시스템의 사용과 결합된 자동화된 고함량 현미경의 기능을 활용하는 것은 단일 실험 캠페인에서 생성할 수 있는 수백, 수천 기가바이트의 다중 매개변수 데이터를 처리, 처리 및 해석하는 데 있어 새로운 잠재적 과제를 제시하고 있습니다. 이는 OOC 실험과 인공 지능 38,39,40,41,42 (AI) 기반 알고리즘 모두의 직접적인 연결을 의미하며, 고급 자동화 분석 및 암-면역 상호작용의 인실리코 모델(in silico model)을 차례로 공급할 수 있는 특징의 생성(43)과 예측 약물 스크리닝 분석(predictive drug screening assay)44의 개발과 같은 흥미진진한 새로운 응용 분야가 지평선에 있습니다.
끊임없이 확장되는 노력의 흐름은 단일 세포 다중 오믹스 판독을 통해 대규모 섭동 스크리닝을 구현하기 위한 전략의 최적화와 함께 질병 모델의 설계에 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 의심할 여지 없이 면역 장애 및 암 전파 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위한 체계적인 onco-immunology-on-a-chip 접근 방식의 적절한 수준의 방법 표준화와 함께 임상 구현에 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 방법은 보다 관련성이 높은 시험관 내 모델의 채택으로 이점을 얻을 수 있는 종양 면역학 분야의 두 가지 중요한 측면을 조정 가능한 복잡성으로 요약하기 위한 일반적인 접근 방식을 설계하려고 합니다. 첫 번째는 종양 세포 집단 측면과 관련이 있으며, 단일 세포 특성을 다루면 치료에 대한 내성, 전이에 대한 성향, 줄기 세포 및 분화 등급을 포함하여 이질성과 상관관계가 있는 생물학적…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Cell culture materials | |||
| 50 mL tubes | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | centrifuge tubes |
| 5-aza-2'-deoxycytidine DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | DNA-hypomethylating agent |
| 6-well plates | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS3506 | culture dishes |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Corning, New York, NY | 430641U | culture flasks |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | CVCL_B222 |
human melanoma cell line |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | anthracycline antibiotic |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0728L | Culture medium for SK-MEL-28 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB4004L | saline buffer solution |
| Fetal Bovine Serum | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECS0180L | ancillary for cell culture |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | separation of mononuclear cells from human blood. |
| hemocytometer | Neubauer | Cell counter | |
| Heparinized vials | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Vials for venous blood collection | |
| interferon alpha-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | recombinant human cytokine |
| L-Glutamine 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3000D | ancillary for cell culture |
| Liquid nitrogen | |||
| Lympholyte cell separation media | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | growth factor reduced basement membrane matrix |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | HTB-26 | human breast cancer cell line |
| Penicillin/ Streptomycin 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3001D | ancillary for cell culture |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Liquid handling |
| PKH26 Red Fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | red fluorescent cell dye |
| PKH67 Green fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH67GL | green fluorescent cell dye |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM2001L | Culture medium for MDA-MB-231 cells |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Liquid handling |
| sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | tips for micropipette |
| Timer | |||
| Trypan Blue solution | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | cell stain to assess cell viability |
| Trypsin | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0920D | dissociation reagent for adherent cells |
| Cell culture equipment | |||
| EVOS-FL fluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Fluorescent microscope for living cells | |
| Humified cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 | Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2 |
| Juli Microscope | Nanoentek | ||
| Laboratory refrigerator (4 °C) | FDM | ||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Steril VBH 72 MP | Laminar flow hood | |
| Optical microscope | Zeiss | ||
| Refrigerable centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thermostatic bath | |||
| Microfabrication materials | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip |
| Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ | MB W&A, Germany | optical masks for photolithography | |
| Glass coverslip, D 263 M Schott glass, (170 ± 5 µm) | Ibidi, Germany | 10812 | |
| Hydrogen Peroxide solution 30% | Carlo Erba Reagents | 412081 | reagents for piranha solution |
| Methyl isobutyl ketone | Carlo Erba Reagents | 461945 | PMMA e-beam resist developer |
| Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm | Sail Brand | 7101 | substrates for bonding chips |
| Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm | Tedpella | dermal biopsy punches for chip reservoirs | |
| PMMA 950 kDa | Allresist,Germany | AR-P. 679.04 | Positive electronic resists for patterning optical masks |
| Polymer untreated coverslips | Ibidi, Germany | 10813 | substrates for bonding chips |
| Prime CZ-Si Wafer, 4”, (100), Boron Doped | Gambetti Xenologia Srl, Italy | 30255 | |
| Propan-2-ol | Carlo Erba Reagents | 415238 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Sigma Aldrich | 484431-4L | SU-8 resists developer |
| SU-8 3005 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0001 | Negative Photoresists |
| SU-8 3050 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0005 | Negative Photoresists |
| Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | dermal biopsy punches for chip reservoirs |
| Sulfuric acid 96% | Carlo Erba Reagents | 410381 | reagents for piranha solution |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dowsil, Dow Corning | 11-3184-01 | Silicone Elastomer (PDMS) |
| Trimethylchlorosilane (TMCS) | Sigma Aldrich | 92360-100ML | silanizing agent for SU-8 patterned masters |
| Microfabrication equipment | |||
| 100 kV e-beam litography | Raith-Vistec EBPG 5HR | ||
| hotplate | |||
| Optical litography system | EV-420 double-face contact mask-aligner | ||
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab 80 plus system | ||
| Vacuum dessicator |
Referências
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