JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Een methodologie voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruimentype hybriden wordt beschreven, die veld- en laboratoriumbestuivingen en waarnemingen van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van S-genotypen door PCR en de monitoring van de bloei voor de selectie van bestuiver.

Abstract

De Japanse pruimencultivars die gewoonlijk worden gekweekt, zijn interspecifieke hybriden die zijn afgeleid van kruisingen tussen de oorspronkelijke Prunus salicina met andere Prunus-soorten. De meeste hybriden vertonen gametofytische zelfincompatibiliteit, die wordt bestuurd door een enkele en zeer polymorfe S-locus die meerdere allelen bevat. De meeste gekweekte hybriden zijn zelfincompatibel en hebben stuifmeel van een compatibele donor nodig om hun bloemen te bevruchten. Het vaststellen van bestuivingseisen bij Japanse pruimen wordt steeds belangrijker door het grote aantal nieuwe cultivars met onbekende bestuivingseisen. In dit werk wordt een methodologie beschreven voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruim-type hybriden. Zelf-(in)compatibiliteit wordt bepaald door handbestuivingen in zowel het veld als in het laboratorium, gevolgd door het monitoren van pollenbuisverlenging met fluorescentiemicroscopie en ook het monitoren van de fruitrijping in het veld. Selectie van bestuivercultivars wordt beoordeeld door de identificatie van S-genotypen door PCR-analyse te combineren met de monitoring van de bloeitijd in het veld. Het kennen van de bestuivingsvereisten van cultivars vergemakkelijkt de selectie van cultivars voor het ontwerp van nieuwe boomgaarden en maakt de vroege detectie van productiviteitsproblemen in verband met bestuivingstekort in gevestigde boomgaarden mogelijk.

Introduction

Japanse pruim(Prunus salicina Lindl.) is inheems in China1. In de19e eeuw werd dit gewas vanuit Japan naar de Verenigde Staten geïntroduceerd, waar het werd gekruist met andere Noord-Amerikaanse diploïde pruimen2. In de 20e eeuw werden sommige van deze hybriden verspreid naar gematigdestreken over de hele wereld. Tegenwoordig verwijst de term “Japanse pruim” naar een breed scala aan interspecifieke hybriden afgeleid van kruisingen tussen de oorspronkelijke P. salicina met maximaal 15 andere diploïde Prunus spp.3,4,5.

Japanse pruim vertoont, net als andere soorten van de Rosaceae-familie, Gametophytic Self-Incompatibility (GSI), die wordt gecontroleerd door een enkele en zeer polymorfe S-locusmet meerdere allelen6. De S-locus bevat twee genen die coderen voor een ribonuclease (S-RNase) uitgedrukt in de stamper, en een F-box eiwit (SFB) uitgedrukt in de stuifmeelkorrel7. In de zelfincompatibiliteitsreactie, wanneer het S-alleluitgedrukt in de stuifmeelkorrel (haploïde) hetzelfde is als een van de twee uitgedrukt in de stamper (diploïde), wordt de groei van de stuifmeelbuis over de stijl gestopt als gevolg van de afbraak van het pollenbuis-RNA door de werking van de S-RNase8. Omdat dit proces bevruchting van de vrouwelijke gametofyt in de eicel voorkomt, bevordert GSI de kruising tussen cultivars.

Hoewel sommige Japanse pruimencultivars zelfcompatibel zijn, zijn de meeste cultivars die momenteel worden gekweekt zelfcompatibel en hebben ze stuifmeel van intercompatibele donoren nodig om hun bloemen te bevruchten3. In steenfruitsoorten van het geslacht Prunus zoals amandel9,abrikoos10,11,12 en zoetekers 13kunnen bestuivingsvereisten van cultivars door verschillende benaderingen worden vastgesteld. Zelf-(in)compatibiliteit kan worden bepaald door zelfbestuiving van bloemen in het veld en daaropvolgende monitoring van vruchtzetting, of door semi-in vivo zelfbestuivingen onder gecontroleerde omstandigheden in een laboratorium en de observatie van stuifmeelbuizen onder de microscoop14,15,16,17,18 . Incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars kunnen worden bepaald door kruisbestuivingen in het veld of in het laboratorium met behulp van stuifmeel van de potentiële bestuivercultivar, en door de identificatie van S-allelen van elke cultivar door PCR-analyse14,15,16,19,20,21,22 . Bij soorten zoals zoete kers of amandel kan zelf-(in)compatibiliteit ook worden beoordeeld door de identificatie van bepaalde S-allelen geassocieerd met zelfcompatibiliteit, zoals S4‘ in zoetekers 13 of Sf in amandel23.

Verschillende pruimenveredelingsprogramma’s uit de belangrijkste producerende landen brengen een aantal nieuwe cultivars2,14uit,waarvan vele met onbekende bestuivingsvereisten. In dit werk wordt een methodologie beschreven voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruim-type hybriden. Zelf-(in)compatibiliteit wordt bepaald door zelfbestuivingen in zowel het veld als het laboratorium, gevolgd door observaties van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie. Selectie van bestuivercultivars combineert de identificatie van S-genotypen door PCR-analyse met de monitoring van de bloeitijd in het veld.

Protocol

1. Handbestuiving in het veld Pollenextractie Om stuifmeel te verkrijgen, verzamel bloemknoppen in stadium D24,volgens fase 57 op de BBCH-schaal25,26.OPMERKING: Meer bloemknoppen zijn nodig in Japanse pruimen dan in andere Prunus-soorten omdat hun helmknoppen minder stuifmeel produceren. Verwijder de helmdoeken met behulp van een plastic gaas (poriegrootte van 2 mm x 2 mm) en le…

Representative Results

Elke Japanse pruimenbloemknop bevat een bloeiwijze met 1-3 bloemen. Net als bij andere steenvruchtensoorten bestaat elke bloem uit vier kransen: carpel, meeldraden, bloemblaadjes en kelkbladen, die zijn samengesmolten tot een beker aan de basis van de bloem. Bloemstructuren zijn kleiner dan andere steenvruchten, met een korte en fragiele stamper omringd door de meeldraden die een kleine hoeveelheid stuifmeelkorrels bevatten. Bij volle bloei lijken de bloemen van elke bloeiwijze gescheiden op korte stengels, met de witte …

Discussion

De hierin beschreven methodologie voor bestuivingsvereisten van Japanse pruimencultivars vereist het bepalen van de zelf-(in)compatibiliteit van elke cultivar door gecontroleerde bestuivingen in het veld of het laboratorium, en de daaropvolgende observatie van pollenbuisgroei met fluorescentiemicroscopie. De incompatibiliteitsrelaties worden vastgesteld door de karakterisering van de S-allelen door moleculaire genotypering. Ten slotte wordt de selectie van bestuivers uitgevoerd door de monitoringfenologie om die…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 en RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Europees Sociaal Fonds, Europese Unie (Grupo Consolidado A12-17R) en Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero werd ondersteund door een fellowship van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología van Mexico (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

Tags

Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy
check_url/pt/61897?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image