Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.
Abstract
De invasie van kankercellen van de primaire tumor in de aangrenzende gezonde weefsels is een vroege stap in uitzaaiingen. Invasieve kankercellen vormen een grote klinische uitdaging omdat er geen efficiënte methode bestaat voor hun eliminatie zodra hun verspreiding aan de gang is. Een beter begrip van de mechanismen die de invasie van kankercellen reguleren, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe krachtige therapieën. Vanwege hun fysiologische gelijkenis met tumoren, sferoïden ingebed in collageen ben ik uitgebreid gebruikt door onderzoekers om de mechanismen voor kankercelinvasie in de extracellulaire matrix (ECM) te bestuderen. Deze bepaling wordt echter beperkt door (1) een gebrek aan controle over de inbedding van sferoïden in het ECM; (2) hoge kosten van collageen I en glazen bodemschotels, (3) onbetrouwbare immunofluorescente etikettering, als gevolg van de inefficiënte penetratie van antilichamen en fluorescerende kleurstoffen en (4) tijdrovende beeldverwerking en kwantificering van de gegevens. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we het driedimensionale (3D) sferoïde protocol geoptimaliseerd om fluorescerend gelabelde kankercellen die zijn ingebed in collageen I in beeld te brengen, hetzij met behulp van time-lapse video’s of longitudinale beeldvorming, en de invasie van kankercellen te analyseren. Ten eerste beschrijven we de fabricage van een sferoïde imaging device (SID) om sferoïden betrouwbaar en in een minimaal collageen I-volume in te sluiten, waardoor de assaykosten worden verlaagd. Vervolgens definiëren we de stappen voor robuuste fluorescentieetikettering van levende en vaste sferoïden. Tot slot bieden we een gebruiksvriendelijke Fiji-macro voor beeldverwerking en gegevenskwantificering. Al met al biedt deze eenvoudige methodologie een betrouwbaar en betaalbaar platform om de invasie van kankercellen in collageen I te monitoren. Bovendien kan dit protocol eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van de gebruikers.
Introduction
Tijdens kankerprogressie kunnen kankercellen een beweeglijk en invasief fenotype krijgen, waardoor ze aan de tumormassa kunnen ontsnappen en in de omliggende weefsels kunnen binnendringen1. Uiteindelijk kunnen deze invasieve kankercellen secundaire organen bereiken en groeien, een proces dat kankermetastasen1wordt genoemd. Uitzaaiingen veroorzaakt meer dan 90% van de kankergerelateerde sterfgevallen2. Een reden hiervoor is dat, hoewel gelokaliseerde tumoren klinisch beheersbaar zijn, er geen efficiënte methoden bestaan voor de eliminatie van invasieve kankercellen zodra gemetastaseerde verspreiding heeft plaatsgevonden. Daarom vormt de opkomst van invasieve kankercellen en de overgang van een gelokaliseerde naar een invasieve ziekte een grote klinische uitdaging. Het bepalen hoe kankercellen een invasief gedrag initiëren en ondersteunen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe krachtige therapieën.
Het 3D-sferoïdemodel is een ideaal platform om het beweeglijke gedrag van kankercellen onder gecontroleerde, maar fysiologisch relevante aandoeningen te onderzoeken3. Inderdaad, in deze test zijn sferoïden van kankercellen ingebed in extracellulaire matrix (ECM), bijvoorbeeld collageen I, dat een vereenvoudigde tumor nabootst. Vervolgens wordt beeldvorming gebruikt om de invasie van kankercellen van het sferoïde in de collageenmatrix te visualiseren. Meerdere uitdagingen beperken deze procedure echter.
De eerste uitdaging vindt plaats bij de insluitstap, waar de vloeibare collageenmatrix zich over het oppervlak van de schotel kan verspreiden, waardoor de sferoïde de onderkant van de schaal raakt. Bijgevolg verspreidden cellen van de sferoïde zich op het tweedimensionale (2D) oppervlak en braken de driedimensionale (3D) sferoïde morfologie. Het verhogen van het volume collageen is een efficiënte, maar kostbare oplossing. Om te voorkomen dat cellen zich op het 2D-oppervlak verspreiden, met behoud van een minimaal collageenvolume, ontwikkelden we een sferoïde beeldvormingsapparaat (SID) door een 1 mm dikke, 3-gaats polydimethylsiloxaan (PDMS) insert op een glazen bodemschaal te verbinden.
De tweede uitdaging van de sferoïdetest is het labelen van kankercellen in sferoïden, die wordt beperkt door de slechte penetratie van antilichamen en fluorescerende kleurstoffen, een effect dat toeneemt met de grootte van de sferoïden. Hoewel de ideale oplossing voor het labelen van cellen de instelling is van cellijnen die fluorescerend eiwit(en) stabiel uitdrukken, is deze optie meestal beperkt tot vereeuwigde cellijnen en wordt beperkt door de beschikbaarheid van fluorescerende eiwit chimera’s. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor immunofluorescentiekleuring van vaste sferoïden, evenals het efficiënte gebruik van een cytoplasmatische kleurstof om cellen onmiddellijk voor het insluiten van de sferoïde te labelen.
De derde uitdaging van de sferoïde test is het ontbreken van eenvoudige Fiji-macro’s voor semi-geautomatiseerde kwantificering van celinvasie in de loop van de tijd. Om deze uitdaging aan te pakken, beschrijven we een eenvoudige methodologie om het sferoïde gebied in de loop van de tijd te analyseren. We illustreren de voordelen van dit protocol aan de hand van de 4T1- en 67NR-cellijnen als voorbeelden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De 3D-geprinte afstandhouder is ontworpen om 1 mm dikke vellen PDMS te maken die vervolgens kunnen worden gebruikt om eenvoudig verschillende vormen van PDMS te maken, zoals vereist door de experimentele toepassingen. Vanwege de eenvoud van de fabricage en de vrijheid om het ontwerp te veranderen, werd deze methode van PDMS-gieten gekozen voor het oorspronkelijke ontwerp van de SID. Als er een hoog volume SIDs nodig is, kan de productie efficiënter worden gemaakt door een 3D-geprinte mal te maken, die al PDMS-schijven m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de leden van Temple Bioengineering bedanken voor waardevolle discussies. We danken David Ambrose van de flow cytometrie kern (Lewis Katz School of Medicine) voor zijn hulp bij celsortering en Tony Boehm van de IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) voor hulp bij het 3D printen. We danken ook onze financieringsmiddelen: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 en R01 CA230777, allemaal aan BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
