Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D
Summary
Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l’imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l’analisi dell’invasione delle cellule tumorali.
Abstract
L’invasione delle cellule tumorali dal tumore primario nei tessuti sani adiacenti è un primo passo nella metastasi. Le cellule tumorali invasive rappresentano una sfida clinica importante perché non esiste un metodo efficiente per la loro eliminazione una volta avviata la loro diffusione. Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l’invasione delle cellule tumorali può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti. A causa della loro fisiologica somiglianza con i tumori, gli sferoidi incorporati nel collagene sono stati ampiamente utilizzati dai ricercatori per studiare i meccanismi che regolano l’invasione delle cellule tumorali nella matrice extracellulare (ECM). Tuttavia, questo saggio è limitato da (1) una mancanza di controllo sull’incorporamento degli sferoidi nell’ECM; (2) costo elevato del collagene I e delle stoviglie di fondo in vetro, (3) etichettatura immunofluorescente inaffidabile, a causa dell’inefficiente penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti e (4) elaborazione delle immagini dispendiosa in termini di tempo e quantificazione dei dati. Per affrontare queste sfide, abbiamo ottimizzato il protocollo sferoide tridimensionale (3D) per immaginire cellule tumorali etichettate fluorescentmente incorporate nel collagene I, utilizzando video time-lapse o imaging longitudinale, e analizzare l’invasione delle cellule tumorali. In primo luogo, descriviamo la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide (SID) per incorporare sferoidi in modo affidabile e in un volume minimo di collagene I, riducendo il costo del saggio. Successivamente, delimitiamo i passaggi per l’etichettatura a fluorescenza robusta di sferoidi vivi e fissi. Infine, offriamo una macro Fiji facile da usare per l’elaborazione delle immagini e la quantificazione dei dati. Complessivamente, questa semplice metodologia fornisce una piattaforma affidabile e conveniente per monitorare l’invasione delle cellule tumorali nel collagene I. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze degli utenti.
Introduction
Durante la progressione del cancro, le cellule tumorali possono acquisire un fenotipo mobile e invasivo, consentendo loro di sfuggire alla massa tumorale e invadere nei tessuticircostanti 1. Alla fine, queste cellule tumorali invasive possono raggiungere e crescere all’interno degli organi secondari, un processo chiamato metastasitumorale 1. La metastasi causa più del 90% dei decessi correlati al cancro2. Una ragione di ciò è che, mentre i tumori localizzati sono clinicamente gestibili, non esistono metodi efficienti per l’eliminazione delle cellule tumorali invasive una volta che si è verificata la diffusione metastatica. Pertanto, l’emergere di cellule tumorali invasive e il passaggio da una malattia localizzata a una malattia invasiva sta ponendo una grande sfida clinica. Determinare come le cellule tumorali avviano e sostengono un comportamento invasivo può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti.
Il modello sferoide 3D è una piattaforma ideale per indagare il comportamento mobile delle cellule tumorali in condizioni controllate, ma fisiologicamente rilevanti3. Infatti, in questo saggio, gli sferoidi delle cellule tumorali sono incorporati all’interno della matrice extracellulare (ECM), ad esempio collagene I, che imita un tumore semplificato. Quindi, l’imaging viene utilizzato per visualizzare l’invasione delle cellule tumorali dallo sferoide nella matrice di collagene. Tuttavia, più sfide limitano questa procedura.
La prima sfida si verifica nella fase di incorporamento, dove la matrice di collagene liquido può diffondersi sulla superficie del piatto, facendo toccare lo sferoide sul fondo del piatto. Di conseguenza, le cellule dello sferoide si diffondono sulla superficie bidimensionale (2D), rompendo la morfologia tridimensionale (3D) dello sferoide. Aumentare il volume del collagene è una soluzione efficiente, ma costosa. Per evitare che le cellule si diffondano sulla superficie 2D, pur mantenendo un volume minimo di collagene, abbiamo sviluppato un dispositivo di imaging sferoide (SID) delimitando un inserto in polidimetilossano a 3 fori (PDMS) spesso 1 mm su un piatto inferiore di vetro.
La seconda sfida del saggio sferoide è l’etichettatura delle cellule tumorali negli sferoidi, che è limitata dalla scarsa penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti, un effetto che aumenta con le dimensioni dello sferoide. Mentre la soluzione ideale per etichettare le cellule è la creazione di linee cellulari che esprimono stabilmente proteine fluorescenti, questa opzione è per lo più limitata alle linee cellulari immortalate ed è limitata dalla disponibilità di chimere proteiche fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per la colorazione immunofluorescenza di sferoidi fissi, nonché l’uso efficiente di un colorante citoplasmatico per etichettare le cellule immediatamente prima di incorporare lo sferoide.
La terza sfida del saggio sferoide è la mancanza di semplici macro delle Fiji per la quantificazione semi-automatizzata dell’invasione cellulare nel tempo. Per affrontare questa sfida, descriviamo una semplice metodologia per analizzare l’area dello sferoide nel tempo. Illustriamo i vantaggi di questo protocollo utilizzando le linee cellulari 4T1 e 67NR come esempi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il distanziale stampato in 3D è stato progettato per creare fogli di PDMS spessi 1 mm che possono quindi essere utilizzati per creare facilmente varie forme di PDMS, come richiesto dalle applicazioni sperimentali. Grazie alla semplicità della sua fabbricazione e alla libertà di alterare il design, questo metodo di fusione PDMS è stato scelto per la progettazione iniziale del SID. Se è richiesto un elevato volume di SID, la produzione può essere resa più efficiente creando uno stampo stampato in 3D, che contiene gi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri di Temple Bioengineering per le preziose discussioni. Ringraziamo David Ambrose al flow cytometry core (Lewis Katz School of Medicine) per la sua assistenza allo smistamento cellulare e Tony Boehm dell’IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) per l’aiuto con la stampa 3D. Ringraziamo anche le nostre risorse di finanziamento: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 e R01 CA230777, tutto a BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
Referências
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