Tidsuppgjord fluorescensavbildning och analys av cancercellsinvasion i 3D-sfäroidmodellen
Summary
Presenteras här är ett protokoll för tillverkning av en sfäroid imaging enhet. Denna enhet möjliggör dynamisk eller longitudinell fluorescensavbildning av cancercellssfäroider. Protokollet erbjuder också en enkel bildbehandlingsprocedur för analys av cancercellsinvasion.
Abstract
Invasionen av cancerceller från den primära tumören i de intilliggande friska vävnaderna är ett tidigt steg i metastasering. Invasiva cancerceller utgör en stor klinisk utmaning eftersom det inte finns någon effektiv metod för att eliminera dem när deras spridning är igång. En bättre förståelse för mekanismerna som reglerar cancercellsinvasion kan leda till utveckling av nya potenta terapier. På grund av deras fysiologiska likhet med tumörer har sfäroider inbäddade i kollagen jag i stor utsträckning använts av forskare för att studera mekanismerna för cancercellsinvasion i den extracellulära matrisen (ECM). Denna analys begränsas dock av (1) bristande kontroll över inbäddningen av sfäroider i ECM. (2) Höga kostnader för kollagen I- och glasbottenfat, 3) otillförlitlig immunofluorescerande märkning på grund av ineffektiv penetration av antikroppar och fluorescerande färgämnen och (4) tidskrävande bildbehandling och kvantifiering av uppgifterna. För att hantera dessa utmaningar optimerade vi det tredimensionella (3D) sfäroidprotokollet för att avbilda fluorescerande märkta cancerceller inbäddade i kollagen I, antingen med hjälp av timelapse-videor eller longitudinell avbildning och analysera cancercellsinvasion. Först beskriver vi tillverkningen av en sfäroid imaging enhet (SID) för att bädda in sfäroider tillförlitligt och i en minimal kollagen I volym, minska analys kostnaden. Därefter avgränsar vi stegen för robust fluorescensmärkning av levande och fasta sfäroider. Slutligen erbjuder vi ett lättanmätt Fiji-makro för bildbehandling och datak kvantifiering. Sammantaget ger denna enkla metodik en pålitlig och prisvärd plattform för att övervaka cancercellsinvasion i kollagen I. Dessutom kan detta protokoll enkelt ändras för att passa användarnas behov.
Introduction
Under cancerprogression kan cancerceller förvärva en motil och invasiv fenotyp, vilket gör det möjligt för dem att undkomma tumörmassan och invadera in i de omgivandevävnaderna 1. Så småningom kan dessa invasiva cancerceller nå och växa inuti sekundära organ, en process som kallas cancermetastas1. Metastasering orsakar mer än 90% av cancerrelaterade dödsfall2. En anledning till detta är att även om lokaliserade tumörer är kliniskt hanterbara, finns det inga effektiva metoder för eliminering av invasiva cancerceller när metastaserad spridning har inträffat. Därför utgör uppkomsten av invasiva cancerceller och övergången från en lokaliserad till en invasiv sjukdom en stor klinisk utmaning. Att bestämma hur cancerceller initierar och upprätthåller ett invasivt beteende kan leda till utveckling av nya potenta terapier.
3D-sfäroidmodellen är en idealisk plattform för att undersöka cancercellernas motila beteende under kontrollerade, men fysiologiskt relevanta förhållanden3. I denna analys är sfäroider av cancerceller inbäddade i extracellulär matris (ECM), till exempel kollagen I, som efterliknar en förenklad tumör. Sedan används avbildning för att visualisera invasionen av cancerceller från sfäroiden till kollagenmatrisen. Flera utmaningar begränsar dock denna procedur.
Den första utmaningen uppstår vid inbäddningssteget, där den flytande kollagenmatrisen kan sprida sig över skålytan, vilket gör att sfäroiden vidrör botten av skålen. Följaktligen spreds celler från sfäroiden på den tvådimensionella (2D) ytan och bröt den tredimensionella (3D) sfäroidmorfologin. Att öka volymen av kollagen är en effektiv men kostsam lösning. För att förhindra att celler sprids på 2D-ytan, samtidigt som vi upprätthåller en minimal volym kollagen, utvecklade vi en sfäroid avbildningsenhet (SID) genom att begränsa en 1 mm tjock, 3-håls polydimethylsiloxane (PDMS) insats på en glasbottenform.
Den andra utmaningen med den sfäroida analysen är märkningen av cancerceller i sfäroider, vilket begränsas av dålig penetration av antikroppar och fluorescerande färgämnen, en effekt som ökar med sfäroidstorleken. Medan den idealiska lösningen för märkning av celler är upprättandet av cellinjer som stabilt uttrycker fluorescerande protein(er), är detta alternativ mestadels begränsat till odödliga cellinjer och begränsas av tillgången på fluorescerande protein chimeras. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för immunofluorescensfärgning av fasta sfäroider, samt effektiv användning av ett cytoplasmiskt färgämne för att märka celler omedelbart innan sfäroiden bäddas in.
Den tredje utmaningen med sfäroidanalysen är bristen på enkla Fiji-makron för halvautomatisk kvantifiering av cellinvasion över tid. För att möta denna utmaning beskriver vi en enkel metodik för att analysera sfäroidområdet över tid. Vi illustrerar fördelarna med detta protokoll med hjälp av 4T1 och 67NR cellinjer som exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den 3D-utskrivna distansen utformades för att skapa 1 mm tjocka ark PDMS som sedan kan användas för att enkelt skapa olika former av PDMS, vilket krävs av de experimentella applikationerna. På grund av enkelheten i dess tillverkning och friheten att ändra designen valdes denna metod för PDMS-gjutning för SID: s ursprungliga design. Om det krävs en hög volym AV SIM-kort kan produktionen effektiviseras genom att skapa en 3D-utskriven form, som redan innehåller PDMS-diskar med tre lika fördelade hål, och minska…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Temple Bioengineering för värdefulla diskussioner. Vi tackar David Ambrose vid flödescytometrikärnan (Lewis Katz School of Medicine) för hans hjälp med cellsortering och Tony Boehm från IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) för hjälp med 3D-utskriften. Vi tackar också våra finansieringsresurser: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 och R01 CA230777, alla till BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
