Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka effekterna av hydraulisk sprickbildning på närliggande vattendrag genom att analysera deras vatten- och sedimentmikrobiella samhällen.
Hydraulisk spräckning (HF), vanligen kallad “fracking”, använder en blandning av högtrycksvatten, sand och kemikalier för att bryta stenar och släppa ut olja och gas. Denna process revolutionerade den amerikanska energiindustrin, eftersom den ger tillgång till resurser som tidigare var ouppnåeliga och nu producerar två tredjedelar av den totala naturgasen i USA. Även om frackning har haft en positiv inverkan på den amerikanska ekonomin, har flera studier belyst dess skadliga miljöeffekter. Särskilt oroande är frackningens inverkan på vattendrag, som är särskilt viktiga på grund av deras oproportionerligt stora inverkan på hela vattendelarens hälsa. Bakterierna i dessa strömmar kan användas som indikatorer på strömhälsa, eftersom bakterierna som finns och deras överflöd i en störd ström förväntas skilja sig från dem i en annars jämförbar men ostörd ström. Därför syftar detta protokoll till att använda bakteriesamhället för att avgöra om strömmar har påverkats av frackning. I detta syfte måste sediment- och vattenprover, från bäckar nära frackning (potentiellt påverkade) och uppströms eller i en annan vattendelare av frackningsaktivitet (obehindrat) samlas in. Dessa prover utsätts sedan för nukleinsyraextraktion, biblioteksberedning och sekvensering för att undersöka mikrobiell samhällssammansättning. Korrelationsanalys och maskininlärningsmodeller kan därefter användas för att identifiera vilka funktioner som är förklarande för variation i samhället, samt identifiering av prediktiva biomarkörer för frackning. Dessa metoder kan avslöja en mängd olika skillnader i de mikrobiella samhällena mellan huvudvattenströmmar, baserat på närheten till frackning, och tjäna som grund för framtida undersökningar om frackningens miljöpåverkan.
Hydraulisk spräckning (HF), eller “fracking”, är en metod för naturgasutvinning, som har blivit allt vanligare i takt med att efterfrågan på fossila bränslen fortsätter att öka. Denna teknik består av att använda högeffektiv borrutrustning för att injicera en blandning av vatten, sand och kemikalier i metanrika skifferfyndigheter, vanligtvis för att frigöra fångade gaser1.
Eftersom dessa okonventionella avverkningsmetoder är relativt nya är det viktigt att undersöka effekterna av sådana metoder på närliggande vattenvägar. Frackningsverksamhet kräver röjning av stora landområden för utrustningstransport och brunnsdynakonstruktion. Cirka 1,2-1,7 hektar mark måste röjs för varje brunnsdyna2, vilket kan påverka avrinningen och vattenkvaliteten i systemet3. Det råder brist på transparens kring den exakta kemiska sammansättningen av frackningsvätska, inklusive vilka biocider som används. Dessutom tenderar fracking avloppsvatten att vara mycket saltlösning2. Dessutom kan avloppsvattnet innehålla metaller och naturligt förekommande radioaktiva ämnen2. Därför är risken för läckor och spill av frackningsvätska på grund av mänskliga fel eller utrustningsfel oroande.
Vattendragsekosystem är kända för att vara mycket känsliga för förändringar i omgivandelandskap 4 och är viktiga för attupprätthålla biologisk mångfald 5 och korrektnäringscykling 6 inom hela vattendelaren. Mikrober är de vanligaste organismerna i sötvattenströmmar och är därför viktiga för näringscykling, biologisk nedbrytning och primärproduktion. Mikrobiell samhällssammansättning och funktion fungerar som bra verktyg för att få information om ekosystemet på grund av deras känslighet för besvär, och ny forskning har visat tydliga förändringar i observerade bakteriella sammansättningar baserade på närhet till frackningsaktivitet7,8. Till exempel identifierades Beijerinckia, Burkholderiaoch Methanobacterium som berikade i strömmar nära fracking medan Pseudonocardia, Nitrospiraoch Rhodobacter berikades i strömmarna inte nära fracking7.
Nästa generations sekvensering av 16S ribosomal RNA (rRNA) genen är en prisvärd metod för att bestämma bakteriell samhällssammansättning som är snabbare och billigare än hela genomsekvenseringsmetoder9. En vanlig praxis inom molekylär ekologi är att använda den mycket varierande V4-regionen i 16S rRNA-genen för sekvenseringsupplösning, ofta ner till släktnivån med ett brett omfång av identifiering9, eftersom det är idealiskt för oförutsägbara miljöprover. Denna teknik har implementerats i stor utsträckning i publicerade studier och har framgångsrikt använts för att identifiera frackningsåtgärders inverkan på vattenmiljöer7,8. Det är dock värt att notera att bakterier har varierande kopieringsnummer av 16S rRNA-genen, vilket påverkar deras upptäckta överflöd10. Det finns några verktyg för att ta hänsyn till detta, men deras effektivitet är tvivelaktig10. En annan praxis som snabbt växer i prevalens och saknar denna svaghet är metatranscriptomic sekvensering, där allt RNA är sekvenserat, så att forskare kan identifiera både aktiva bakterier och deras gener uttryck.
I motsats till metoder i tidigare publicerade studier7,8,11,12, omfattar detta protokoll därför också provtagning, bevarande, bearbetning och analys för undersökning av mikrobiell samhällsfunktion (metatranscriptomics). Stegen som beskrivs häri gör det möjligt för forskare att se vilken inverkan, om någon, frackning har haft på gener och vägar uttryckta av mikrober i sina strömmar, inklusive antimikrobiella resistensgener. Dessutom förbättras den detaljnivå som presenteras för provtagning. Även om flera av stegen och anteckningarna kan tyckas uppenbara för erfarna forskare, kan de vara ovärderliga för dem som just börjat forskningen.
Häri beskriver vi metoder för provtagning och bearbetning för att generera bakteriegenetiska data som ett sätt att undersöka frackningens inverkan på närliggande bäckar baserat på våra labbs flera års erfarenhet. Dessa data kan användas i nedströmsapplikationer för att identifiera skillnader som motsvarar frackningsstatus.
De metoder som beskrivs i detta dokument har utvecklats och förfinats under flera studier som publicerats av vår grupp mellan 2014 och 20187,8,10 ochhar använts framgångsrikt i ett samarbetsprojekt för att undersöka frackningens inverkan på vattensamhällen i ett treårigt projekt som snart kommer att skicka in ett papper för publicering. Dessa metoder kommer att fortsätta att användas under återstoden av projektet. Dessutom beskriver annan aktuell litteratur som undersöker frackningens inverkan på strömmar och ekosystem liknande metoder för provtagning, bearbetning och analys7,8,10,11. Emellertid använde ingen av dessa papper metatranscriptomic analys, vilket gör detta dokument den första att beskriva hur dessa analyser kan användas för att klargöra frackings inverkan på närliggande strömmar. Dessutom är de metoder som presenteras här för provtagning mer detaljerade, liksom de åtgärder som vidtagits för att undvika kontaminering.
Ett av de viktigaste stegen i vårt protokoll är inledande provtagning och bevarande. Fältprovtagning och insamling kommer med vissa utmaningar, eftersom det kan vara svårt att upprätthålla en aseptisk eller steril miljö under insamlingen. Under detta steg är det viktigt att undvika att förorena prover. För att göra detta bör handskar bäras, och endast sterila behållare och verktyg bör tillåtas komma i kontakt med prover. Prover bör också omedelbart placeras på is efter insamling för att mildra nedbrytningen av nukleinsyran. Att tillsätta ett kommersiellt konserveringsmedel för nukleinsyra vid insamling kan också öka nukleinsyrautbytet och göra det möjligt att lagra prover under längre perioder efter insamlingen. När nukleinsyraextraktion utförs är det viktigt att använda lämplig mängd prov, för mycket kan täppa till spinnfilter som används för extraktion (för de protokoll som använder dem) men för lite kan resultera i låga utbyten. Var noga med att följa instruktionerna för vilken sats som används.
I likhet med fältinsamling är det också viktigt att undvika eller minimera kontaminering under utvinning av nukleinsyra och provberedning, särskilt vid arbete med prover med låg nukleinsyrautbyte, såsom suboptimala sedimentprover (prover som innehåller en stor mängd grus eller stenar) eller vattenprover. Därför, som med provuppsamling, bör handskar bäras under alla dessa steg för att minska föroreningen. Dessutom bör alla arbetsytor som används under labbprocedurer steriliseras i förväg genom att torka med en 10% blekmedelslösning, följt av en 70% etanollösning. För rörningssteg (3-6) bör filterspetsar användas för att undvika förorening på grund av själva pipetten, med spetsar som ändras varje gång de rör vid en icke-steril yta. Alla verktyg som används för labbarbete, inklusive pipetter, bör torkas av före och efter med blekmedels- och etanollösningarna. För att utvärdera kontaminering bör extraktionsämnen och negativ (steril vätska) inkluderas under varje uppsättning nukleinsyraextraktioner och PCR-reaktioner. Om kvantifiering efter extraktioner visar en påvisbar mängd DNA/RNA i negativerna, kan extraktioner upprepas om det finns tillräckligt med prov kvar. Om negativa prover för PCR visar förstärkning bör felsökning utföras för att bestämma källan och sedan ska proverna köras igen. För att ta hänsyn till låga föroreningsnivåer rekommenderas att extraktionsämnen och PCR-negativ sekvenseras så att föroreningarna kan identifieras och avlägsnas vid behov under beräkningsanalysen. Omvänt kan PCR-förstärkning också misslyckas på grund av en mängd olika orsaker. För miljöprover är hämning av PCR-reaktionen ofta den skyldige, vilket kan bero på en mängd olika ämnen som stör Taq-polymeras23. Om hämning misstänks kan PCR-vatten (se materialförteckning)användas för att späda ut DNA-extrakten.
Detta protokoll har några anmärkningsvärda begränsningar och potentiella svårigheter. Provtagning kan vara utmanande för både vatten- och sedimentprover. För att få tillräckligt med biomassa måste helst 1 L strömvatten skjutas genom ett filter. Filtrets porer måste vara små för att fånga mikrober men kan också fånga sediment. Om mycket sediment finns i vattnet på grund av den senaste tidens nederbörd kan filtret täppa till vilket gör det svårt att trycka hela volymen genom filtret. För sedimentuppsamling kan det vara utmanande att uppskatta sedimentdjupet under insamlingen. Dessutom är det viktigt att se till att sedimentet som samlas in huvudsakligen är jord, eftersom småsten och stenar kommer att leda till lägre nukleinsyrautbyte och kanske inte är en korrekt representation av det mikrobiella samhället. Slutligen är det också viktigt att prover hålls på is efter insamling, särskilt om ett konserveringsmedel inte används.
Även om detta protokoll täcker både metatranscriptomics och 16S lab protokoll, bör det betonas att dessa två metoder är mycket olika i både processen och i den typ av data de tillhandahåller. 16S rRNA-genen är en allmänt riktad region, mycket bevarad i bakterier och arkéer, och användbar för att karakterisera bakteriesamhället i ett prov. Även om det är ett målinriktat och specifikt tillvägagångssätt är upplösningen på artnivå ofta ouppnåelig, och det är svårt att karakterisera nysspionerade arter eller stammar. Kontrarily är metatranscriptomics ett bredare tillvägagångssätt som fångar alla aktiva gener och mikrober som finns i ett prov. Medan 16S endast tillhandahåller data för identifiering, kan metatranscriptomics tillhandahålla funktionella data såsom uttryckta gener och metaboliska vägar. Båda är värdefulla och när de kombineras kan de avslöja vilka bakterier som finns och vilka gener de uttrycker.
Detta dokument beskriver metoder för fält insamling och prov bearbetning för både 16S rRNA och metatranscriptomic analyser i samband med studier fracking. Dessutom specificerar den insamlingsmetoder för högkvalitativt DNA / RNA från prover med låg biomassa och för långtidslagring. De metoder som beskrivs här är kulmen på våra erfarenheter av provtagning och bearbetning i våra ansträngningar att lära oss hur frackning påverkar närliggande strömmar genom att undersöka strukturen och funktionen hos deras mikrobiella samhällen. Mikrober reagerar snabbt på störningar, och följaktligen vilka mikrober som finns och vilka gener de uttrycker kan ge information om frackningens effekter på ekosystemen. Sammantaget kan dessa metoder vara ovärderliga i vår förståelse för hur frackning påverkar dessa viktiga ekosystem.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna finansieringskällorna för de projekt som ledde till utvecklingen av dessa metoder, med dessa källor: Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) genom Precollege and Undergraduate Science Education Program, liksom av National Science Foundation (http://www.nsf.gov) genom NSF-utmärkelser DBI-1248096 och CBET-1805549.
200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |