Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов
Summary
Здесь представлен протокол для доставки олигонуклеотидов, таких как малоинтерферная РНК (siRNA), микро-РНК-мимики (miRs) или анти-микро-РНК (anti-miR) в зрелые адипоциты для модуляции экспрессии белка и микро-РНК.
Abstract
Изменение функции адипоцитов способствует патогенезу метаболических заболеваний, включая диабет 2 типа и резистентность к инсулину. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Модуляция экспрессии белков и микро-РНК в адипоцитах остается очень сложной задачей. В данной работе описан протокол дифференцировки мышиных фибробластов в зрелые адипоциты и модуляции экспрессии белков и микро-РНК в зрелых адипоцитах посредством обратной трансфекции с использованием малоинтерферирующих РНК (siRNA) и микро-РНК, имитирующих (miR-mimic) олигонуклеотидов. Этот протокол обратной трансфекции включает инкубацию трансфекционного реагента и олигонуклеотидов с образованием комплекса в пластине клеточной культуры, к которой добавляются зрелые адипоциты. Затем адипоцитам дают повторно прикрепиться к поверхности адгезивной пластины в присутствии комплекса олигонуклеотидов/трансфекционных реагентов. Функциональные анализы, такие как изучение передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза, могут быть выполнены на трансфектированных зрелых адипоцитах 3T3-L1 для изучения влияния манипуляций с белком или микро-РНК на функцию адипоцитов.
Introduction
Ожирение считается основным фактором риска для многочисленных метаболических заболеваний, включая резистентность к инсулину (IR), диабет 2 типа (T2D) и сердечно-сосудистые заболевания1. Современные методы лечения не смогли остановить постоянно растущую распространенность этих заболеваний, и управление ИК пациентов с ожирением и диабетом остается важной клинической проблемой. Жировая ткань играет важнейшую роль в контроле энергетического гомеостаза, а ее патологическое расширение при ожирении способствует развитию ИК иСД22,3. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Многие исследования изучали роль кодирующих белок РНК в физиологии адипоцитов и их связь с ожирением.
Совсем недавно открытие некодирующих РНК (ncRNAs), особенно микро-РНК (miRs), создало новые концепции, связанные с механизмом регуляции программ экспрессии генов. Исследования показали, что нРНК являются важными регуляторами функции адипоцитов, и что их дисрегуляция играет важную роль при метаболических заболеваниях4. Таким образом, манипуляции с белками и ncРНК в адипоцитах имеют решающее значение для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их влияния на такие патологии, как СД2. Тем не менее, манипулирование экспрессией белков и ncRNAs in vivo, а также в первичных адипоцитах остается очень сложным, что способствует использованию моделей адипоцитов in vitro.
Мышиные фибробласты 3T3-L1 легко дифференцируются в зрелые, функциональные и инсулин-чувствительные адипоциты, которые представляют собой хорошо охарактеризованные клеточные линии, используемые для изучения функции адипоцитов (например, передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липолиза и секреции адипокинов)5,6,7,8,9,10. Эти свойства делают адипоциты 3T3-L1 привлекательной моделью для модуляции экспрессии кодирующих белок и nc-РНК для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их потенциальной роли в заболеваниях, связанных с ожирением. К сожалению, в то время как фибробласты 3T3-L1 легко трансфектируются с использованием коммерчески доступных реагентов, дифференцированные адипоциты 3T3-L1 являются одной из самых сложных клеточных линий для трансфектации. Вот почему многочисленные исследования, манипулируя экспрессией генов в клетках 3T3-L1, были сосредоточены на дифференцировке адипоцитов, а не на функции адипоцитов.
Долгое время единственным эффективным методом трансфектации адипоцитов была электропорация5,которая утомительна, дорога и может вызвать повреждение клеток. В этой статье сообщается о методе обратной трансфекции с использованием общего трансфекционного реагента, который сокращает практическое время для трансфекции, не влияет на жизнеспособность клеток и намного дешевле, чем электропорация. Этот протокол идеально подходит для трансфекции siRNA и других олигонуклеотидов, таких как микро-РНК-мимики (miR-мимики) и антимир-мимики. Принцип протокола обратной трансфекции заключается в инкубации трансфекционного реагента и олигонуклеотидов для образования комплекса в пластине клеточной культуры, а затем посева зрелых адипоцитов в колодцы. Затем адипоциты повторно прикрепляются к поверхности адгезивной пластинки в присутствии комплекса реагентов олигонуклеотидов/трансфекции. Эта простая, эффективная и недорогая методология позволяет изучать роль кодирующих белок РНК и миР в функции адипоцитов и их потенциальную роль в заболеваниях, связанных с ожирением.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе представлен подробный протокол дифференцировки и трансфекции зрелых адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, siRNAs, микро-РНК-мимика и анти-ми?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана INSERM, Университетом Лазурного берегу и Французским национальным исследовательским агентством (ANR) в рамках программы «Инвестиции для будущей Лаборатории передового опыта» (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) и «Инициатива передового опыта» (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. поддерживается грантами От Французского сообщества диаспоры (SFD), Французской ассоциации исследований и исследований в области обезите (AFERO), Института технологий мультигезитов в санте (ITMO) и Фонда Бенджамина-Делессерта. J.G. поддерживается ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. поддерживается грантом ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 и грантом Фонда по области ремерче-едикаля (Equipe FRM, DEQ20180839587). Мы также благодарим Центр визуализации C3M, финансируемый Департаментом Приморских Альп и Région PACA, который также поддерживается платформой микроскопии и визуализации GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Referências
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
