מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים
Summary
מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.
Abstract
שינוי בתפקוד אדיפוזיטים תורם לפתוגנזה של מחלות מטבוליות כולל סוכרת מסוג 2 ועמידות לאינסולין. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. אפנון הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים נותר מאתגר מאוד. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להבדיל בין פיברובלסטים מורין לאדיפוציטים בוגרים ולווסת את הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים בוגרים באמצעות תעתיק הפוך באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA) ומיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים. פרוטוקול תעתיק הפוך זה כרוך בדגורה של ריאגנט טרנס-זיהום והאוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בלוח תרביות התא שאליו מתווספים האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, אדיפוציטים מורשים לחבר מחדש למשטח הלוח החסידי בנוכחות קומפלקס הריאגנט אוליגונוקלאוטידים/טרנספקטריון. ניתוחים פונקציונליים כגון המחקר של איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ליפוליזה יכול להתבצע על אדיפוזיטים בוגרים 3T3-L1 כדי לחקור את ההשפעה של חלבון או מניפולציה מיקרו-RNA על תפקוד אדיפוזיט.
Introduction
השמנת יתר נחשבת לגורם סיכון מרכזי למחלות מטבוליות רבות, כולל תנגודת לאינסולין (IR), סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות לב וכלי דם1. הטיפולים הנוכחיים לא הצליחו לעצור את השכיחות הגואה המתמדת של מחלות אלה, וניהול IR של חולי שמנים וחולי סוכרת נותר נושא קליני חשוב. רקמת השומן ממלאת תפקיד מכריע בשליטה על הומאוסטזיס אנרגיה, וההתרחבות הפתולוגית שלה במהלך השמנת יתר תורמת להתפתחות של IR ו- T2D2,3. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. מחקרים רבים חקרו את התפקיד של RNAs קידוד חלבון בפיזיולוגיה אדיפוציטים ואת הקשר שלהם עם השמנת יתר.
לאחרונה, הגילוי של RNAs שאינם קידוד (ncRNAs), במיוחד מיקרו-RNAs (miRs), זייף מושגים חדשניים הקשורים למנגנון הרגולציה של תוכניות ביטוי גנים. מחקרים הראו כי ncRNAs הם רגולטורים חשובים של תפקוד אדיפוציטים, וכי dysregulation שלהם ממלא תפקיד חשוב במחלות מטבוליות4. לכן, מניפולציה של חלבונים ו NCRNAs ב adipocytes הוא חיוני כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת השפעתם על פתולוגיות כגון T2D. עם זאת, מניפולציה של ביטוי של חלבונים ו ncRNAs ב vivo, כמו גם adipocytes ראשוני נשאר מאתגר מאוד, העדפת השימוש במודלים אדיפוציטים במבחנה.
פיברובלסטים מורין 3T3-L1 בקלות להבדיל לתוך adipocytes בוגר, פונקציונלי, תנגודת לאינסולין, שהם קו תאים מאופיין היטב המשמש לחקר תפקוד אדיפוזיט (למשל, איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipolysis והפרשת אדיפוקינים)5,6,7,8,9,10. מאפיינים אלה הופכים את 3T3-L1 לאידיפוציטים מודל אטרקטיבי כדי לווסת את הביטוי של קידוד חלבונים ו- NC-RNAs כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת תפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר. למרבה הצער, בעוד 3T3-L1 פיברובלסטים קל להעביר באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית, מודיפוציטים 3T3-L1 מובחנים הם אחד מקווי התא הקשים ביותר כדי להעביר. זו הסיבה שמחקרים רבים המתמרנים ביטוי גנים בתאי 3T3-L1 התמקדו בבידול אדיפוציטים ולא בתפקוד אדיפוציטים.
במשך זמן רב, הטכניקה היעילה היחידה כדי טרנספקט adipocytes היה electroporation5, וזה מייגע, יקר, והוא יכול לגרום נזק לתא. מאמר זה מדווח על טכניקת טרנס-טרנס-זיהום באמצעות ריאגנט תעתיק נפוץ, אשר מפחית את הזמן מעשי עבור transfection, אין השפעה על הכדאיות התא, והוא הרבה פחות יקר מאשר electroporation. פרוטוקול זה מתאים באופן מושלם לתרגום של siRNA ואוליגונוקלאוטידים אחרים כגון מיקרו-RNA מחקה (מחקה miR) ואנטי-miRs. העיקרון של פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הפוך הוא לדגור על ריאגנט הטרנס-זיהום ואת האוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בצלחת תרבית התא ואז לזרוע את אדיפוציטים בוגרים לתוך הבארות. לאחר מכן, אדיפוציטים לחבר מחדש את פני הלוח דבק בנוכחות קומפלקס ריאגנט אוליגונוקלאוטידים / transfection. מתודולוגיה פשוטה, יעילה וזולה זו מאפשרת לחקור את תפקידם של RNAs ו- miRs קידוד חלבונים בתפקוד אדיפוציטים ותפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידול ולהדבקה של אדיפוציטים בוגרים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להדבקת אוליגונוקלאוטידים כגון, אך לא רק, siRNAs, מיקרו-RNA מחקה, ואנטי מיקרו-RNAs לתוך אדיפוציטים 3T3-L1, שהוא אחד מקווי התא הקשים ביותר לבצע תעתיק. לשיטה זו יש כמה מגבל?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת חוף ד’אזור, וסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות התוכנית השקעות למעבדת המצוינות העתידית (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ויוזמת המצוינות (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. נתמך על ידי מענקים מן Société Francophone du Diabète (SFD), האגודה Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), המכון Thématique Multi-Organismes טכנולוגיות לשפוך לה סנטה (ITMO), ואת פונדציה בנג’מין-Delessert. J.G. נתמך על ידי ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. נתמך על ידי מענק ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ומענק מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M הממומן על ידי קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-ימיים ו- Région PACA, הנתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופיה והדמיה GIS IBiSA חוף ד’אזור (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Referências
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
