En adipocytcellekulturmodel til undersøgelse af protein- og mikro-RNA-gradueringens indvirkning på adipocytfunktionen
Summary
Præsenteret her er en protokol til at levere oligonukleotider såsom små-interfererende RNA (siRNA), mikro-RNA efterligner (miRs), eller anti-mikro-RNA (anti-miR) i modne adipocytter til at modulere protein og mikro-RNA udtryk.
Abstract
Ændring af adipocytfunktion bidrager til patogenesen af metaboliske sygdomme, herunder type 2-diabetes og insulinresistens. Dette understreger behovet for bedre at forstå den molekylære mekanisme, der er involveret i adipocyt dysfunktion til at udvikle nye behandlinger mod fedme-relaterede sygdomme. Det er fortsat meget udfordrende at modulere ekspressionen af proteiner og mikro-RNA’er i adipocytter. Dette papir beskriver en protokol til at differentiere murin fibroblaster i modne adipocytter og til at modulere udtrykket af proteiner og mikro-RNA efterligne (miR efterligne) oligonukleotider. Denne omvendte transfection protokol indebærer inkubation af transfection reagens og oligonukleotider til at danne et kompleks i cellen kultur plade, som de modne adipocytter tilsættes. Adipocytterne får derefter lov til at fastgøres til den klæbende pladeoverflade i nærværelse af oligonucleotider /transfection reagenskomplekset. Funktionelle analyser såsom studiet af insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipogenese og lipolyse kan udføres på de transfected 3T3-L1 modne adipocytter for at studere virkningen af protein- eller mikro-RNA-manipulation på adipocytfunktionen.
Introduction
Fedme betragtes som en stor risikofaktor for mange metaboliske sygdomme, herunder insulinresistens (IR), Type 2 Diabetes (T2D) og hjerte-kar-sygdomme1. Nuværende behandlinger har undladt at stoppe den konstant stigende forekomst af disse sygdomme, og håndteringen af IR af overvægtige og diabetiske patienter er fortsat et vigtigt klinisk problem. Fedtvæv spiller en afgørende rolle i kontrollen af energi homøostase, og dens patologiske ekspansion under fedme bidrager til udviklingen af IR og T2D2,3. Dette understreger behovet for bedre at forstå den molekylære mekanisme, der er involveret i adipocyt dysfunktion til at udvikle nye behandlinger mod fedme-relaterede sygdomme. Mange forskningsundersøgelser har undersøgt den rolle, protein-kodning RNA’er i adipocyt fysiologi og deres tilknytning til fedme.
For nylig har opdagelsen af ikke-kodende RNA’er (ncRNAs), især mikro-RNA’er (miR’er), smedet nye begreber relateret til mekanismen for regulering af genekspressionsprogrammer. Undersøgelser har vist, at nc RNA’er er vigtige regulatorer af adipocyt funktion, og at deres dysregulering spiller en vigtig rolle i metaboliske sygdomme4. Således manipulation af proteiner og ncRNAs i adipocytter er afgørende for at dechifrere deres roller i adipocyt funktion og deres indvirkning på patologier såsom T2D. Men, manipulere udtrykket af proteiner og ncRNAs in vivo samt i primære adipocytter er fortsat meget udfordrende, favorisere brugen af in vitro adipocyt modeller.
Murine 3T3-L1 fibroblaster skelner let til modne, funktionelle og insulin-responsive adipocytter, som er en velkarakteriseret cellelinje, der bruges til at studere adipocytfunktion (f.eks. insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipolyse og adipokiner sekretion)5,6,7,8,9,10. Disse egenskaber gør 3T3-L1 adipocytter til en attraktiv model til at modulere ekspressionen af proteinkodning og nc-RNA’er for at dechifrere deres rolle i adipocytfunktion og deres potentielle rolle i fedmerelaterede sygdomme. Desværre, mens 3T3-L1 fibroblaster er nemme at transfect ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser, differentierede 3T3-L1 adipocytter er en af de sværeste cellelinjer at transfekte. Dette er grunden til talrige undersøgelser manipulere genekspression i 3T3-L1 celler har fokuseret på adipocyt differentiering snarere end på adipocyt funktion.
I lang tid var den eneste effektive teknik til at transfect adipocytter elektroporation5, hvilket er kedeligt, dyrt og kan forårsage celleskader. Dette papir rapporterer en omvendt transfection teknik ved hjælp af en fælles transfection reagens, som reducerer hands-on tid til transfection, har ingen effekt på celle levedygtighed, og er langt billigere end elektroporation. Denne protokol er perfekt egnet til transfektion af siRNA og andre oligonukleotider såsom mikro-RNA efterligner (miR efterligner) og anti-miRs. Princippet i reverse-transfection protokollen er at inkubere transfection reagens og oligonuleotider til at danne et kompleks i cellen kultur plade og derefter så de modne adipocytter i brønde. Derefter fastgøres adipocytterne til den klæbende pladeoverflade i nærværelse af oligonucleotider / transfection reagenskompleks. Denne enkle, effektive og billige metode gør det muligt at studere den rolle, som proteinkodnings-RNA’er og miR’er spiller i adipocytfunktionen og deres potentielle rolle i fedmerelaterede sygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir præsenterer en detaljeret protokol for differentiering og transfection af modne adipocytter. Denne omvendte transfektionsmetode er en enkel, økonomisk og meget effektiv metode til at transfectoligonucleotider som, men ikke begrænset til, siRNAs, mikro-RNA efterligner og anti-mikro-RNA’er i 3T3-L1 adipocytter, som er en af de sværeste cellelinjer at transfect. Denne metode har nogle begrænsninger, der skal overvejes. Denne protokol er ikke effektiv til transfektion med plasmid DNA, hvilket begrænser nytt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af INSERM, Université Côte d’Azur og det franske nationale forskningsagentur (ANR) gennem programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) og Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. støttes af tilskud fra Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) og Fondation Benjamin-Delessert. J.G. understøttes af ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. støttes af ANR-tilskud ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 og et tilskud fra Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansieret af Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, som også støttes af GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Referências
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
