एडिपोसाइट फंक्शन पर प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए मॉड्यूलेशन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक एडिपोसाइट सेल कल्चर मॉडल
Summary
यहां प्रस्तुत प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए अभिव्यक्ति को मिलाने के लिए परिपक्व एडिपोसाइट्स में छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिराना), माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर), या एंटी-माइक्रो-आरएनए (एंटी-एमआईआर) जैसे ओलिगोन्यूक्लियोट्स देने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Abstract
एडिपोसाइट फ़ंक्शन का परिवर्तन टाइप 2 मधुमेह और इंसुलिन प्रतिरोध सहित मेटाबोलिक रोगों के रोगजनन में योगदान देता है। यह मोटापे से संबंधित रोगों के खिलाफ नए उपचार विकसित करने के लिए adipocyte शिथिलता में शामिल आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है । एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मॉडुलन करना बेहद चुनौतीपूर्ण रहता है। यह पत्र मुरीन फाइब्रोब्लास्ट को परिपक्व एडिपोसाइट्स में अंतर करने और छोटे हस्तक्षेप वाले आरएनए (सिरएनए) और माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफेक्शन के माध्यम से परिपक्व एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल में ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की इनक्यूबेशन शामिल है ताकि सेल कल्चर प्लेट में एक जटिल बनाया जा सके, जिससे परिपक्व एडिपोसाइट्स जोड़े जाते हैं। इसके बाद एडिपोसाइट्स को ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स/ट्रांसफैक्शन रिएजेंट कॉम्प्लेक्स की मौजूदगी में अनुयायी प्लेट की सतह पर फिर से संलग्न करने की अनुमति है । इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस के अध्ययन जैसे कार्यात्मक विश्लेषण ों को संक्रमित 3T3-L1 परिपक्व एडिपोसाइट्स पर किया जा सकता है ताकि आदिपोसाइट फ़ंक्शन पर प्रोटीन या माइक्रो-आरएनए हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन किया जा सके।
Introduction
मोटापा इंसुलिन प्रतिरोध (आईआर), टाइप 2 मधुमेह (T2D), और हृदय रोगों 1 सहित कई चयापचय रोगों के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक मानाजाताहै । वर्तमान चिकित्सा इन रोगों की लगातार बढ़ती व्यापकता को रोकने में विफल रहे हैं, और मोटापे से ग्रस्त और मधुमेह रोगियों के आईआर के प्रबंधन एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दा बना हुआ है । एडिपोस ऊतक ऊर्जा होमोस्टेसिस के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और मोटापे के दौरान इसका रोग विस्तार आईआर और टी 2डी2,3के विकास में योगदानदेताहै। यह मोटापे से संबंधित रोगों के खिलाफ नए उपचार विकसित करने के लिए adipocyte शिथिलता में शामिल आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है । कई शोध अध्ययनों में एडिपोसाइट फिजियोलॉजी में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए की भूमिका और मोटापे के साथ उनके जुड़ाव की जांच की गई है ।
हाल ही में, गैर-कोडिंग आरएनए (एनसीआरएन), विशेष रूप से माइक्रो-आरएनए (एमआईआरएस) की खोज ने जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के नियमन के तंत्र से संबंधित उपन्यास अवधारणाओं को जाली कर दिया है। अध्ययनों से पता चला है कि एनसीआरएन एडिपोसाइट फ़ंक्शन के महत्वपूर्ण नियामक हैं, और उनका डिस्रेगुलेशन मेटाबोलिक रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है4। इस प्रकार, आदिपोसाइट्स में प्रोटीन और एनसीआरएन का हेरफेर आदिपोसाइट फ़ंक्शन में उनकी भूमिकाओं और टी2डी जैसी विकृतियों पर उनके प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, वीवो के साथ-साथ प्राथमिक एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और एनसीआरएन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करना अत्यधिक चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, जो इन विट्रो एडिपोसाइट मॉडल के उपयोग के पक्ष में है।
मुरीन 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट आसानी से परिपक्व, कार्यात्मक, और इंसुलिन-उत्तरदायी एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जो एक अच्छी तरह से विशेषता वाली सेल लाइन है जिसका उपयोग एडिपोसिट फ़ंक्शन (जैसे, इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोलिसिस और एडिपोकिन्स स्राव) का अध्ययन करने के लिए किया जाता है)5,6,7,8,9,10। ये गुण 3T3-L1 adipocytes को प्रोटीन-कोडिंग और एनसी-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाते हैं ताकि एडीपोसाइट फ़ंक्शन में उनकी भूमिका और मोटापे से संबंधित बीमारियों में उनकी संभावित भूमिका को समझा जा सके। दुर्भाग्य से, जबकि 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट्स का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट करना आसान है, विभेदित 3T3-L1 adipocytes ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे कठिन सेल लाइनों में से एक हैं। यही कारण है कि 3T3-L1 कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने वाले कई अध्ययनों ने एडिपोसाइट फ़ंक्शन के बजाय एडीपोसाइट भेदभाव पर ध्यान केंद्रित किया है।
लंबे समय तक, एडिपोसाइट्स को स्थानांतरित करने के लिए एकमात्र कुशल तकनीक इलेक्ट्रोपॉयशन5थी, जो थकाऊ, महंगा है, और सेल क्षति का कारण बन सकती है। यह पेपर एक आम ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफैक्शन तकनीक की रिपोर्ट करता है, जो ट्रांसफैक्शन के लिए हाथों को समय पर कम करता है, सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, और इलेक्ट्रोपॉनेशन की तुलना में बहुत कम महंगा है। यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से सिरना और अन्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जैसे माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) और एंटी-एमआईआर के ट्रांसफेक्शन के लिए अनुकूल है। रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल का सिद्धांत कोशिका संस्कृति प्लेट में एक जटिल बनाने के लिए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को इनक्यूबेट करना और फिर परिपक्व एडीपोसाइट्स को कुओं में बीज करना है। फिर, एडिपोसाइट्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स/ट्रांसफैक्शन रीएजेंट कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति में अनुयायी प्लेट सतह पर फिर से संलग्न होते हैं। यह सरल, कुशल और सस्ती पद्धति एडिपोसाइट फ़ंक्शन में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए और एमआईआर की भूमिका और मोटापे से संबंधित बीमारियों में उनकी संभावित भूमिका के अध्ययन की अनुमति देती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पत्र परिपक्व एडिपोसाइट्स के भेदभाव और स्थानांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह रिवर्स-ट्रांसफेक्शन विधि ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को स्थानांतरित करने के लिए एक सरल, किफायती और अत…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को INSERM, Université कोटे डी अज़ूर, और फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) द्वारा भविष्य की प्रयोगशाला उत्कृष्टता के लिए कार्यक्रम निवेश के माध्यम से समर्थित किया गया था (लैबेक्स सिग्नलिफे-एएनआर-11-लैबएक्स-0028-01) और उत्कृष्टता की पहल (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001)। जेजे को सोसिएट फ्रैंकोफोन डु डायबेट (एसएफडी), एसोसिएशन फ्रैंकोइस डी एट्यूड एट डी रेचेचे सुर एल ओबेसिटे (एएफईआरओ), इंस्टिट्यूट थेमेटिक मल्टी-ऑर्गेन्स टेक्नोलॉजीज डालना ला सैंटे (आईटीएमओ), और प्रियतम बेंजामिन-डीलेसर्ट के अनुदानों द्वारा समर्थित है। जेजी ANR-18-CE14-0035-01 द्वारा समर्थित है । जे-एफटी को एएनआर ग्रांट ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 द्वारा समर्थित किया जाता है और प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (इक्विप एफआरएम, DEQ20180839587) से अनुदान । हम Conseil Départemental des Alpes-Maritimes और रेगियन PACA द्वारा वित्त पोषित C3M की इमेजिंग कोर सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं, जिसे जीआईएस आईबिसा माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म कोटे डी अज़ूर (MICA) द्वारा भी समर्थित किया जाता है।
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Referências
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