タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル
Summary
ここでは、小干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA模倣体(miRs)、抗マイクロRNA(抗miR)などのオリゴヌクレオチドを成熟したアディポサイトに送達し、タンパク質およびマイクロRNA発現を調節するプロトコルを紹介します。
Abstract
アディポサイト機能の変化は、2型糖尿病およびインスリン抵抗性を含む代謝性疾患の病因に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。アディポサイトにおけるタンパク質および マイクロRNAの 発現を調節することは、依然として非常に困難である。本論文では、マウス線維芽細胞を成熟したアディポ細胞に分化し、小干渉RNA(siRNA)およびマイクロRNA模倣(miR模倣)オリゴヌクレオチドを用いた逆トランスフェクションを通じて成熟したアディポ細胞におけるタンパク質およびマイクロRNAの発現を調節するプロトコルについて述べている。この逆トランスフェクションプロトコルは、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドのインキュベーションを含み、成熟したアディポサイトが添加される細胞培養プレートに複合体を形成する。次に、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で、接着板表面に再び付着させられます。インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、脂肪分解の研究などの機能解析を、トランスフェクトした3T3-L1成熟脂肪細胞に対して行い、脂肪細胞機能に対するタンパク質またはマイクロRNA操作の影響を研究することができます。
Introduction
肥満は、インスリン抵抗性(IR)、2型糖尿病(T2D)、および心血管疾患1を含む多数の代謝性疾患の主要な危険因子と考えられている。現在の治療法は、これらの疾患の絶えず増加する有病率を止めることができず、肥満および糖尿病患者のIRの管理は依然として重要な臨床的問題である。脂肪組織は、エネルギー恒常性の制御に重要な役割を果たし、肥満時のその病理学的拡張は、IRおよびT2D2、3の発達に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。多くの研究は、アディポサイト生理学におけるタンパク質コードRNAの役割と肥満との関連を調査してきました。
最近では、非コードRNA(ncRNA)、特にマイクロRNA(miRs)の発見は、遺伝子発現プログラムの調節機構に関連する新しい概念を偽造している。研究は、ncRNAが、有数細胞細胞機能の重要な調節因子であり、その調節不調が代謝性疾患において重要な役割を果たしていることを示している。したがって、アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの操作は、アディポサイト機能におけるそれらの役割とT2Dなどの病理への影響を解読するために重要である。しかし、生体内および一次アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの発現を操作することは依然として非常に困難であり、体外の椎骨細胞モデルの使用を支持する。
Mtune 3T3-L1線維芽細胞は、脂肪細胞機能(例えば、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪分解および脂肪分泌)5、6、7、8、9、10を研究するために使用される十分に特徴付けられる細胞株である成熟した、機能的、およびインスリン応答性脂肪細胞に容易に分化する。これらの特性は、3T3-L1アディポサイトを、タンパク質コードおよびnc-RNAの発現を調節し、有分細胞機能におけるその役割と肥満関連疾患における潜在的な役割を解読する魅力的なモデルにする。残念ながら、3T3-L1線維芽細胞は市販の試薬を使用してトランスフェクトしやすいのに対し、分化された3T3-L1アディポサイトはトランスフェクトするのが最も困難な細胞株の1つである。このため、3T3-L1細胞における遺伝子発現を操作する数多くの研究が、アディポサイト機能ではなく、アディポサイト分化に焦点を当てています。
長い間、アディポ細胞をトランスフェクトする唯一の効率的な技術はエレクトロポレーション5であり、これは退屈で高価であり、細胞損傷を引き起こす可能性があります。本論文では、トランスフェクションの実用時間を短縮する一般的なトランスフェクション試薬を用いた逆トランスフェクション技術を報告し、細胞の生存率に影響を及ぼさないため、エレクトロポレーションよりもはるかに安価である。このプロトコルは、マイクロRNA模倣(miR模倣)および抗miRsのようなsiRNAおよび他のオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに完全に適している。逆トランスフェクションプロトコルの原理は、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドをインキュベートして細胞培養プレートに複合体を形成し、成熟したアディポサイトをウェルに播種する。次いで、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で接着板表面に再び付着する。このシンプルで効率的で安価な方法論は、有数体細胞機能におけるタンパク質コードRNAおよびmiRの役割と肥満関連疾患におけるその潜在的な役割の研究を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、成熟したアディポサイトの分化とトランスフェクションに関する詳細なプロトコルを紹介する。この逆トランスフェクション法は、トランスフェクトが最も困難な細胞株の1つである3T3-L1アディポサイトにsiRNA、マイクロRNA模倣、および抗マイクロRNAのようなオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする簡便で経済的で効率の高い方法である。この方法には、考慮する必要がある?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、将来の優秀研究所(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)とイニシアティブ・オブ・エクセレンス(アイデックス・UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001)を通じて、INSERM、コート・ダジュール大学、フランス国立研究機関(ANR)によって支援されました。J.J.は、ソシエテ・フランコフォン・デュ・ディアベテ(SFD)、フランソワーズ・デチュード・エ・ド・レシェルシュ・シュル・ロベシテ(AFERO)、テマティク・マルチ・オーガミーズ・テクノロジーズ・インスティトゥート・ド・サンテ(ITMO)、フォンダシオン・ベンジャミン・デレッサーの助成金を受けています。J.G.はANR-18-CE14-0035-01でサポートされています。J-F.T.はANRグラントADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01とフォンダシオンからの助成金は、ラ・レシェルシュ・メディカル(エクイペFRM、DEQ20180839587)によってサポートされています。また、コンセイル・デ・アルプ・マリティームが出資するC3Mのイメージング・コア・ファシリティと、GIS IBiSA顕微鏡・イメージング・プラットフォームコート・ダジュール(MICA)が支援するレジオンPACAに感謝します。
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Referências
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