En Adipocyte-cellekulturmodell for å studere virkningen av protein- og mikro-RNA-modulering på adipocyttfunksjon
Summary
Presentert her er en protokoll for å levere oligonukleotider som små forstyrrende RNA (siRNA), mikro-RNA-etterligninger (miRs) eller antimikro-RNA (anti-miR) i modne adipocytter for å modulere protein og mikro-RNA-uttrykk.
Abstract
Endring av adipocyttfunksjon bidrar til patogenese av metabolske sykdommer, inkludert type 2 diabetes og insulinresistens. Dette understreker behovet for å bedre forstå den molekylære mekanismen som er involvert i adipocyt dysfunksjon for å utvikle nye terapier mot fedmerelaterte sykdommer. Modulering av uttrykket av proteiner og mikro-RNAer i adipocytter er fortsatt svært utfordrende. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å differensiere murinfibroblaster i modne adipocytter og for å modulere uttrykket av proteiner og mikro-RNAer i modne adipocytter gjennom omvendt transfeksjon ved hjelp av små forstyrrende RNA (siRNA) og mikro-RNA-etterligning (miR-etterligning) oligonukleotider. Denne omvendte transfeksjonsprotokollen innebærer inkubasjon av transfeksjonsreagenset og oligonukleotidene for å danne et kompleks i cellekulturplaten som de modne adipocyttene legges til. Adipocyttene får da lov til å feste seg til den festende plateoverflaten i nærvær av oligonukleotider / transfeksjonsreagenskomplekset. Funksjonelle analyser som studiet av insulinsignalering, glukoseopptak, lipogenese og lipolyse kan utføres på de transfiserte 3T3-L1 modne adipocyttene for å studere virkningen av protein- eller mikro-RNA-manipulasjon på adipocyttfunksjon.
Introduction
Fedme regnes som en viktig risikofaktor for mange metabolske sykdommer, inkludert insulinresistens (IR), type 2 diabetes (T2D) og kardiovaskulære sykdommer1. Nåværende terapier har ikke klart å stoppe den stadig økende forekomsten av disse sykdommene, og håndteringen av IR av overvektige og diabetikere er fortsatt et viktig klinisk problem. Fettvev spiller en avgjørende rolle i kontrollen av energi homeostase, og den patologiske ekspansjonen under fedme bidrar til utviklingen av IR og T2D2,3. Dette understreker behovet for å bedre forstå den molekylære mekanismen som er involvert i adipocyt dysfunksjon for å utvikle nye terapier mot fedmerelaterte sykdommer. Mange forskningsstudier har undersøkt rollen som proteinkoding RNAer i adipocytt fysiologi og deres tilknytning til fedme.
Mer nylig har oppdagelsen av ikke-kodende RNAer (ncRNAer), spesielt mikro-RNAer (miRs), smidd nye konsepter knyttet til mekanismen for regulering av genuttrykksprogrammer. Studier har vist at ncRNAer er viktige regulatorer for adipocyttfunksjon, og at deres dysregulering spiller en viktig rolle i metabolske sykdommer4. Dermed er manipulering av proteiner og ncRNAer i adipocytter avgjørende for å dechiffrere sine roller i adipocyttfunksjon og deres innvirkning på patologier som T2D. Imidlertid er manipulering av uttrykket av proteiner og ncRNAer in vivo så vel som i primære adipocytter fortsatt svært utfordrende, og favoriserer bruken av in vitro-adipocyttmodeller.
Murine 3T3-L1 fibroblaster skiller seg lett ut i modne, funksjonelle og insulinresponsive adipocytter, som er en godt karakterisert cellelinje som brukes til å studere adipocyttfunksjon (f.eks. insulinsignalering, glukoseopptak, lipolyse og adipokines sekresjon)5,6,7,8,9,10. Disse egenskapene gjør 3T3-L1 adipocytter til en attraktiv modell for å modulere uttrykket av proteinkoding og nc-RNAer for å dechiffrere sin rolle i adipocyttfunksjon og deres potensielle rolle i fedmerelaterte sykdommer. Dessverre, mens 3T3-L1 fibroblaster er enkle å transfektere ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser, er differensierte 3T3-L1-adipocytter en av de vanskeligste cellelinjene å transfektere. Dette er grunnen til at mange studier som manipulerer genuttrykk i 3T3-L1 celler har fokusert på adipocyttdifferensiering i stedet for på adipocyttfunksjon.
I lang tid var den eneste effektive teknikken for å transfektere adipocytter elektroporasjon5, noe som er kjedelig, dyrt og kan forårsake celleskade. Dette papiret rapporterer en omvendt transfeksjonsteknikk ved hjelp av et vanlig transfeksjonsreagens, som reduserer praktisk tid for transfeksjon, har ingen effekt på celle levedyktighet, og er mye billigere enn elektroporasjon. Denne protokollen er perfekt egnet for transfeksjon av siRNA og andre oligonukleotider som mikro-RNA-etterligninger (miR-etterligninger) og anti-miRs. Prinsippet for omvendt transfeksjonsprotokoll er å inkubere transfeksjonsreagenset og oligonukleotidene for å danne et kompleks i cellekulturplaten og deretter frø de modne adipocyttene inn i brønnene. Deretter festes adipocyttene til den festende plateoverflaten i nærvær av oligonukleotider / transfeksjonsreagenskomplekset. Denne enkle, effektive og rimelige metodikken tillater studiet av rollen som proteinkoding RNAer og miRs i adipocyttfunksjon og deres potensielle rolle i fedmerelaterte sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for differensiering og transfeksjon av modne adipocytter. Denne omvendte transfeksjonsmetoden er en enkel, økonomisk og svært effektiv metode for å transfektere oligonukleotider som, men ikke begrenset til, siRNAer, mikro-RNA-etterligninger og antimikro-RNAer til 3T3-L1-adipocytter, som er en av de vanskeligste cellelinjene å transfektere. Denne metoden har noen begrensninger som må vurderes. Denne protokollen er ikke effektiv for transfeksjon med plasmid DNA, noe …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Université Côte d’Azur og Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) gjennom programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) og Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. støttes av tilskudd fra Société Francophone du Diabète (SFD), Foreningen Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) og Fondation Benjamin-Deltesert. J.G. støttes av ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. støttes av ANR grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 og et stipend fra Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansiert av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, som også støttes av GIS IBiSA Microscopy og Imaging Platform Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Referências
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
