Dette papir præsenterer en strategi for opbygning af begrænsede elementmodeller af fiberledende materialer, der udsættes for et elektrisk felt (EF). Modellerne kan bruges til at estimere den elektriske indgang, som celler, der er seedet i sådanne materialer, modtager, og vurdere virkningen af at ændre stilladsets materialeegenskaber, struktur eller retning.
Kliniske undersøgelser viser elektrisk stimulation (ES) at være en potentiel behandling for helbredelse og regenerering af forskellige væv. Forståelse af celleresponsmekanismerne, når de udsættes for elektriske felter, kan derfor være retningsgivende for optimering af kliniske anvendelser. In vitro-eksperimenter har til formål at hjælpe med at afdække dem og giver fordelen ved bredere input- og outputområder, der kan vurderes etisk og effektivt. Fremskridtene i in vitro-eksperimenter er imidlertid vanskelige at reproducere direkte i kliniske miljøer. Hovedsagelig skyldes det, at de ES-enheder, der anvendes in vitro, adskiller sig betydeligt fra dem, der er egnede til patientbrug, og stien fra elektroderne til de målrettede celler er anderledes. Det er derfor ikke let at omsætte in vitro-resultaterne til in vivo-procedurer. Vi understreger, at det cellulære mikromiljøs struktur og fysiske egenskaber spiller en afgørende rolle i de faktiske eksperimentelle testbetingelser og foreslår, at foranstaltninger til fordeling af ladninger kan bruges til at bygge bro mellem in vitro og in vivo. I betragtning af dette viser vi, hvordan i silico finite elementmodellering (FEM) kan bruges til at beskrive det cellulære mikromiljø og de ændringer, der genereres af eksponering for elektriske felter (EF). Vi fremhæver, hvordan EF par med geometrisk struktur til at bestemme afgift distribution. Vi viser derefter virkningen af tidsafhængige input på opladningsbevægelser. Endelig demonstrerer vi relevansen af vores nye metode i silicomodel ved hjælp af to casestudier: (i) in vitrofibrøs Poly(3,4-ethylendioxythiophene) poly (styrenesulfonat) (PEDOT-PSS) stilladser og (ii) i vivo kollagen i ekstracellulær matrix (ECM).
ES er brugen af EF’er med det formål at kontrollere biologiske celler og væv. Dens mekanisme er baseret på den fysiske stimulus, der overføres til cellen, når biomolekylerne inde og omkring den udsættes for en eksternt genereret spændingsgradient. Ladede partikler er involveret i en organiseret bevægelse, der er underlagt Coulombs lov, og genererer trækkræfter på de uladede partikler. Den resulterende væskestrøms- og opladningsfordeling ændrer celleaktiviteter og funktioner som vedhæftning, sammentrækning, migration, orientering, differentiering og spredning1, når cellen forsøger at tilpasse sig ændringen i mikromiljøet.
Da EF’er er kontrollerbare, ikke-invasive, ikke-farmakologiske og vist sig at have en effektiv indvirkning på vigtig celleadfærd, er ES et værdifuldt værktøj til vævsteknik og regenerativ medicin. Det er med succes blevet brugt til at guide neurale2,skelet3,hjertemusklen4,knogle5 og hud6 udvikling. Da det desuden forbedrer iontophoresis7, bruges det som en alternativ eller supplerende behandling til konventionelle farmakologiske. Dens effektivitet i smertebehandling er stadig debatteret som højere kvalitet kliniske forsøg afventes8,9,10. Ikke desto mindre blev der ikke rapporteret om bivirkninger , og det har potentiale til at forbedre patientvelfærden11,12,13,14,15.
Mens kun kliniske forsøg kan give en endelig dom for effekten af en procedure, in vitro og i silico modeller er forpligtet til at informere udformningen af forudsigelig ES behandling, da de giver stærkere kontrol over en bredere vifte af eksperimentelle tilstande. De undersøgte kliniske anvendelser af ES er knogle regenerering16,17, inddrivelse af denervated muskler18,19, axonal regenerering efter operation20,21, smertelindring22, sårheling23,24,25 og iontophoretic stof levering26. For at ES-enheder kan indføres bredt på alle mulige målapplikationer, har kliniske forsøg endnu ikke etableret stærkere beviser for effektiv behandling. Selv på områder, hvor både in vivo dyre- og humane undersøgelser konsekvent rapporterer positive resultater, det store antal rapporterede metoder kombineret med for lidt vejledning om, hvordan man vælger mellem dem og høj anskaffelsespris afskrækker klinikere fra at investere i ES-enheder27. For at overvinde dette kan målvævet ikke længere behandles som en sort boks (grænse for in vivo-forsøg), men skal ses som en kompleks synergi mellem flere delsystemer (figur 1).
Der er i årenes løb gennemført flere ES-forsøg på in vitro ,29,30,31,32,33,34. De fleste af disse karakteriserer kun ES gennem spændingsfaldet mellem elektroderne divideret med afstanden mellem dem – en grov tilnærmelse af den elektriske feltstyrke. Det elektriske felt i sig selv påvirker dog kun ladede partikler, ikke celler direkte. Når der er flere materialer mellem enheden og cellerne, kan den grove tilnærmelse muligvis heller ikke holde.
En bedre karakterisering af indgangssignalet kræver et klart overblik over, hvordan stimulus overføres til cellen. De vigtigste metoder til levering af ES er direkte, kapacitive og induktive kobling35,36. Anordningerne for hver metode er forskellige med elektrodetypen (stang, planar eller vikling) og placering i forhold til målvævet (i kontakt eller isoleret)35. Enheder, der anvendes in vivo til længere behandlinger skal være wearable, således elektroder og de fleste gange energikilden er enten implanteret eller fastgjort til huden som sår forbindinger eller elektroaktive pletter. Den genererede spænding gradient displaces ladede partikler i behandlingsområdet.
Da det påvirker den resulterende ladede partikelstrøm i nærheden af cellerne, er stilladsstruktur af største betydning i udformningen af ES-protokoller. Der opstår forskellige opladningstransportkonfigurationer, hvis platformmaterialet, synteseteknikken, strukturen eller retningen i forhold til spændingsgradientændringen. In vivo påvirkes tilgængeligheden og bevægelsen af ladede partikler ikke kun af celler, men også af kollagennetværket og interstitiel væske, der udgør den understøttende ECM. Manipulerede stilladser bruges i stigende grad til bedre at genskabe naturlige cellemikromiljøer in vitro1,35. Samtidig er ECM et komplekst naturligt stillads.
Kunstige stilladser er baseret på metaller, ledende polymerer og kulstof, konstrueret med fokus på at afbalancere biokompatibilitet med elektrokemisk ydeevne og langsigtet stabilitet36. En alsidig stilladstype er elektrospunfibrøs måtten, der tilbyder en kontrollerbar nanoskala topografi. Dette kan konstrueres til at ligne ECM, og dermed levere lignende mekaniske signaler, der hjælper regenerering af en bred vifte af væv37. For at påvirke ES betydeligt skal måtterne være ledende til en vis grad. Ledende polymerer er imidlertid vanskelige at elektrospin og blanding med isolerende bærere begrænser ledningsevnen af de resulterende fibre38. En løsning er polymerisering af en ledende monomer på overfladen af en dielektrisk fiber, hvilket resulterer i god mekanisk styrke og elektriske egenskaber ved slutproduktet38. Et eksempel er belægning silke elektrospun fibre med semi ledende PEDOT-PSS39. Kombinationen af mekaniske og elektromagnetiske signaler accelererer neuritvæksten40,41,42betydeligt . Neuritter følger stilladser fibre tilpasning, og forlænge mere efter udsættelse for en EF parallelt med fibrene end til en lodret en43. På samme måde fremmer tilpasningen af fiberstilladser til EF også myogen modning33.
ECM består hovedsageligt af fiberdannende proteiner44, hvoraf den kollagentype I er den vigtigste bestanddel i alt animalsk væv bortset fra brusk (rig på kollagentype II)44. Tropocollagen (TC), tredobbelt spiralformation af polypeptidstrenge, er det strukturelle motiv af kollagenfibriller45. Transmission elektron mikroskopi og atomare kraft mikroskopi billeder af kollagen fibriller viser en D-periodisk banded mønster46 forklaret af Hodge &Petruska model47 som regelmæssige arrays af TC huller og overlapninger45. Sener er sammensat af en justeret kollagen fibrillar matrix afskærmet af en ikke-kollagen meget hydrofil proteoglycan matrix48,49. Decorin er en lille leucin-rige proteoglycan (SLRP) i stand til at binde kløften regioner kollagen fibrils og forbinde med andre SLRPs gennem deres glycosaminoglycan (GAG) sidekæder49. Undersøgelser udført på sener viser, at deres elektriske egenskaber ændrer sigbetydeligt,når hydreret50,51, afgift transportmekanisme skifte fra protonisk til ionisk som hydrering niveau stiger51. Dette tyder på, at elektrisk ledning langs en kollagen type I fibril kunne aktiveres af en Decorin-vand frakke, med hul og overlappende regioner, der har forskellige elektriske ledningsevner og dielektriske konstanter.
Da kunstige stilladser giver samme genskabelse af ECM, synes den viden, der skaber synergi mellem in vivo og in vitro, og som kan oversættes, at bevirke, at være i en blindgyde. I silico modellering ikke kun re-muliggør oversættelse mellem de to, men tilføjer også vigtige fordele i at karakterisere de ukendte processer, der er involveret i ES. Sammenligning af in vivo-observationerne med in vitro kan give oplysninger om koblingsstyrken mellem målvævet og resten af organismen, men afdækker ikke de nuværende videngrænser. Det ukendte kan eksponeres ved at observere forskellen mellem, hvad der forventes at ske baseret på den nuværende viden, og hvad der sker. I silico eksperimenter baseret på matematisk modellering tillader opdeling af processen i kendte og ukendte underprocesser. På denne måde kommer fænomener, der ikke er taget højde for i modellen, frem i lyset, når der i silico-forudsigelser sammenlignes med in vitro- og in vivo-eksperimenter.
Formning og test af hypoteser vedrørende den eller de underliggende mekanismer for, hvordan celler og væv påvirkes af elektriske felter, hindres af det store antal parametre52, der skal testes separat. For at definere repræsentative forsøgsbetingelser skal ES-processen opdeles i underprocesser (figur 1), og der skal identificeres dominerende inputsignaler, der påvirker celleadfærden. Modeller, der repræsenterer grundlæggende fysiske virkninger af ES på celler, beskriver det domæne, der parrer EF med cellen – den af ladede partikler53. Adfærden af partikler udvendigt til cellen afhænger af mikromiljøet og kan undersøges separat fra cellen. Det dominerende inputsignal for cellen er undersættet af ES-enhedsoutput, der forårsager den største grad af variation i celleresponset. Den mindste delmængde af de fulde eksperimentelle parametre, der kan generere variationer i alle de dominerende celleinputsignaler, kan bruges til at reducere parameterrumsdimensionen og antallet af testsager.
Inputtet af den biologiske ES-målmodel skal være en delmængde af de udgangssignaler, der produceres af ES-enheden, og som er nyttige til at beskrive ES’s fysiske virkninger på celler. En simpel bioreaktor med direkte kobling har samme struktur som elektrolytiske elektrokemiske celler. Modeller af disse viser den primære (tegner sig for opløsning modstand), sekundære (også tegner sig for faradiske reaktioner) eller tertiære (også tegner sig for ion diffusion) nuværende tæthed fordeling. Da kompleksiteten udmønter sig i beregningsomkostninger, er den enkleste model bedst egnet til udforskning af parameterrum. Simuleringer af fiberkompositter motiveret af materialeegenskaber54 fokuserer på bulkmaterialeegenskaber som følge af kompleks mikroarkitektur og kan derfor ikke beskrive lokale virkninger af eksponering for miljøaftryk. Eksisterende i silicomodeller, motiveret af ES, fokuserer på den biologiske prøve, det være sig en enkelt celle nedsænket i et homogent medium55,56,57eller komplekst væv med homogent ekstracellulært rum58. Opladning og strømtæthed (figur 2) kan fungere som grænsefladesignaler mellem modeller af ES-enheden og den biologiske prøve eller mellem forskellige komponenter i ES-enheden. Den foreslåede FEM-baserede protokol anvender de ligninger, der er beskrevet i figur 2, og blev brugt til at undersøge, hvordan stilladsafhængige parametre kan bruges til at modulere disse to signaler, uafhængigt af den miljømæssige værdi, der genereres af en direkte koblingsopsætning. Resultaterne understreger, at det er nødvendigt at tage højde for stilladser eller ECM elektriske egenskaber, når man undersøger, hvordan ES påvirker målceller.
Den foreslåede protokol foreslår en ensartet modelleringsløsning for naturlige og kunstige stilladser og understreger behovet for at overveje nanostrukturen af fiberstilladser, når man inspicerer virkningerne af miljøaftryk på celler, der er seedet på sådanne materialer. Selv om en grov tilnærmelse af EF-intensiteten (elektrode potentiel forskel divideret med afstanden mellem elektroderne) ville få os til at forvente en feltstyrke på 100 mV/mm, forudsiger simuleringer stationære feltstyrker op til 30% højere i forskellige områder af måtten (Figur 5). Dette resultat bør være af interesse for ES eksperiment design og data fortolkning, som celledød kan være forårsaget af for stærke EF’er. At udsætte det elektriske mikromiljø ville muliggøre en direkte sammenhæng mellem ES og cellulær udvikling. Mens flere undersøgelser præsenterer detaljeret morfologianalyse af de anvendte stilladser33,43,59, undersøger de ikke samspillet mellem materialernes struktur, elektriske egenskaber og EF. Denne protokol kan aktivere dette link, da parametre som fiberradius, belægningslagtykkelse, afstand mellem fibre og elektriske egenskaber af komponentmaterialerne kan ændres i henhold til hvert eksperiment ved at ændre de globale definitioner ved trin 1.2 og 1.3. Derfor kan tilpassede 3D rumligt løst afgift og nuværende tæthed forudsigelser gøres for både statiske og dynamiske ES regimer.
Stillads designoptimering kan målrettes gennem RNC- og RNCd-modellerne med udforskninger af bredt parameterområde, skalering af de foreslåede morfologier eller dele af dem. Alternativt kan andre stilladskonfigurationer undersøges med den foreslåede protokol ved at ændre arraytyperne fra lineær til tredimensionel i afsnit 1.6.5 og tilpasse stilladsgeometrien i punkt 1.6.2. Stilladsoptimering kan dog ikke udføres uden et mål. Mens der til vævsteknik formål hovedfokus er celle skæbne, et klarere billede af, hvad stimuli er dens vigtigste determinanter er afgørende, hvis dens pålidelige kontrol ønskes. Opladning og strømtæthed er gode deskriptorer af cellulære elektriske mikromiljøer, da de viser samspillet mellem EF og de elektriske egenskaber af de forskellige komponentmaterialer i komplekse stilladser som ECM. Protokollen viser, hvordan man beregner forudsigelser for disse målinger givet en nanofibrous stillads geometri og fremhæver betydningen af tilpasningen vinkel af fibrene med EF. Forudsigelser af opladning og strømtæthed kan derefter knyttes til cellulær udvikling, og derfor kan stillads- og ES-regimer derefter optimeres til specifikke opgaver.
Interessant nok viser en undersøgelse, at eksponeringen for høj grad genererede mekanisk stress mere end dobbelt så stor styrke i kompositfilm med nanofibre vinkelret på den eksterne ef sammenlignet med film med paralleljustering60. Den rapporterede mekaniske stress kan være et resultat af Coulomb kræfter, der virker mellem ladede fibre, forudsagt af den uslebne model simuleringer (RC, RNC, RNCd) (Figur 6). Selvom disse simuleringer kunne være nyttige til at undersøge denne hypotese, skal det bemærkes, at de rapporterede eksperimentelle resultater blev opnået i et system med kapacitive kobling, og simuleringen præsenterer direkte kobling.
En begrænsende faktor for fremtidige mulige anvendelser af protokollen til at estimere et cellulært indgangssignal er parameterusikkerhed. Geometriske usikre parametre er belægning lagtykkelse og afstand mellem fiber kerner. Den første kunne udledes ved at finde den værdi, der fører til en bulk impedans, der kan eksperimentelt valideres. Den anden kan udvindes fra høj opløsning materiale scanninger. Parametre, der beskriver materialernes fysiske egenskaber, påvirkes også af usikkerhed. Den elektriske ledningsevne og dielektriske konstant af eksemplificerede materialer adskiller sig imidlertid langt mere end eksperimentel målepræcision (tabel 2). De rapporterede virkninger vil derfor blive opretholdt på trods af moderate målefejl.
Resultaterne viser, hvordan ikke nok modelkompleksitet kan skjule relevante oplysninger. Det er vigtigt at erkende, at protokollen simulerer en forenklet version af det fysiske fænomen, der finder sted, da den ikke tager højde for de forskellige materialer, der er involveret i processen – leder (elektroder), halvleder (belægning), dielektriske (fiberkerner) og elektrolytiske (omgivende stof) – der er i stand til at påvirke opladningstransport. Dette problem kan forklares i fremtidige modeludvidelser ved at tilføje forsinkelser i energioverførslerne på grænsefladerne (dvs. faradiske reaktioner) og iontransportforsinkelser inden for elektrolytten. Tilføjelse af kompleksitet bør dog styres af eksperimentel validering, da en simpel model, der gengiver det meste af det, der observeres, er mere nyttig end en bemærkelsesværdig nøjagtig model, der tilføjer lidt mere information, men er dybt følsom over for mange konstituerende parametres usikkerhed.
Da det endelige mål med vævsteknik er at skabe bioreaktorer, der ikke kun efterligner et eller to aspekter af in vivo-miljøer, men replikerer og styrer alle cellulære udviklingssignaler61, skal elektromagnetiske og mekaniske i silicomodeller samt modeller for varmeoverførsel mellem bioreaktorkomponenter kombineres. I en efterfølgende modelleringsfase kan der også tilføjes koblingsfænomener mellem disse interaktioner såsom ohmisk opvarmning, elektrolytisk væskestrøm, morfologiske stilladsdeformationer som reaktion på elektrisk stimulation60 og piezoelektrisk62. Modeller bør dog først flettes, når hver enkelt er blevet eksperimentelt valideret. På denne måde kan vi få en bedre forståelse af hver komponents indflydelse i det cellulære mikromiljø, og hvordan stimuli kan optimeres.
Hvis den foreslåede model er eksperimentelt valideret, kan den kombineres med modeller af biologiske celler – Figur 1. Opladningstæthedsmønstre og moduleringer kan asymmetrisk påvirke specifikke ionpumpers aktivitet, påvirke fastgørelse til proteinfiberen, der driver membranvedhæftning63 og dermed guide migration, spredningsmønstre og morfogenese64. At udforske disse hypoteser er vejen frem i forståelsen af de mekanismer, der understøtter vævs- og celleresponser på ES.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det 4-årige Wellcome Trust PhD-program i kvantitativ &biofysisk biologi
Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module | COMSOL | – | FEM modelling software |