इस प्रकाशन में, हम दोहरी-मोडलेसी रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग का उपयोग करते हुए वीवो में चूहों में एयरवे म्यूकोसिलीरी क्लीयरेंस (एमसीसी) का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक दोहरी SPECT/CT प्रणाली में माउस पूरे शरीर (MWB) कॉलेमेटर का उपयोग करके एक फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) और गणना टोमोग्राफी (सीटी) अधिग्रहण प्रोटोकॉल के लिए डिज़ाइन किया गया है ।
श्वसन मोटिवल सिलिया, कोशिका के विशेष ऑर्गेनेल्स, श्वसन तंत्र को अस्तर करने वाली एपिथेलियल कोशिकाओं की एपिकल सतह को लाइन करते हैं। मेटाक्रोनल, सिंक्रोनल फैशन में पिटाई करके, ये कई, मोटिवल, ऐक्टिन-आधारित ऑर्गेनेल्स साँस लेने वाले प्रदूषकों और रोगजनकों के श्वसन तंत्र को साफ करने वाला सिफलाड द्रव प्रवाह उत्पन्न करते हैं। बढ़ते पर्यावरण प्रदूषण, उपन्यास वायरल रोगजनकों और उभरते बहु-दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया के साथ, फेफड़ों के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए सिलिया जनित म्यूकोसिलिएरी क्लीयरेंस (एमसीसी) आवश्यक है। एमसीसी प्राथमिक सिलियरी डिस्किनेशिया, सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ-साथ क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज जैसे अधिग्रहीत विकारों जैसे कई जन्मजात विकारों में भी उदास है । इन सभी विकारों की स्थापना की है, कुछ मामले में कई, माउस मॉडल । इस प्रकाशन में, हम वीवो में चूहों में एमसीसी को सही और पुन: उत्पन्न करने के लिए रेडियोधर्मिता और दोहरे-मोडलिटी SPECT/CT इमेजिंग की एक छोटी राशि का उपयोग करके एक विधि का विस्तार करते हैं । विधि इमेजिंग के बाद चूहों की वसूली के लिए अनुमति देता है, धारावाहिक माप संभव बना रही है, और समय के साथ संभावित चिकित्सीय परीक्षण। जंगली प्रकार के चूहों में डेटा एमसीसी माप की पुन: उत्पन्नता को दर्शाता है जब तक विस्तार पर पर्याप्त ध्यान दिया जाता है, और प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन किया जाता है।
सिलिया सूक्ष्मतुबुल आधारित सेलुलर ऑर्गेनेल्स हैं जो शैवाल से मनुष्यों तक विकासवादी इतिहास में संरक्षित हैं। वे कोशिका की सतहों से निकलते हैं और1कई कार्य होते हैं, जो स्थानीय पर्यावरणीय संवेदी संकेतों की मान्यता से लेकर गतिशीलता तक होते हैं, ऐसे कार्य जिन्हें मनुष्यों से प्रारंभिक एककोशिकीय यूकेरियोटिक जीवों में वापस खोजा जा सकता है2,3। सिलिया पर्यावरण संकेतों को संसाधित करने के लिए सेल के विशेष एंटीना के रूप में गैर-गतिशील और एकल सेवारत हो सकता है; या मोती और मल्टीपल, सिंक्रोनाइज्ड, मेटाक्रोनल तरंगों में पिटाई तरल प्रवाह उत्पन्न करने के लिए, जैसे फैलोपियन ट्यूबों और ऊपरी और निचले वायुमार्ग की परत में, टर्मिनल ब्रोंकिओल्स को छोड़कर अल्वियोली1,2.
श्वसन तंत्र की व्यापक एपिथेलियल सतह संभावित खतरनाक साँस प्रदूषकों और रोगजनकों की एक किस्म के रूप में संदूषण की एक निरंतर बौछार के संपर्क में है, एक रक्षा की आवश्यकता है । एक प्रमुख रक्षा तंत्र श्वासनली पेड़ का म्यूकोसिलियरी तंत्र है, जहां स्रावित बलगम का एक सतत प्रवाह यांत्रिक रूप से ट्रेको-ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं की एपिकल सतहों को अस्तर करने वाले कई मोटिवल सिलिया की धड़कन से वायुमार्ग से बाहर ले जाया जाता है। ये सांस लेने वाले संदूषकों को फंसाने के लिए कार्य करते हैं, और उनके निरंतर, समकालिक पिटाई के माध्यम से, उन्हें सिफलाड4,5परिवहन करते हैं।
सिलिया को भ्रूण के विकास में बाएं-दाएं पैटर्निंग के विकास में महत्वपूर्ण भूमिकाओं का प्रदर्शन किया गया है, जहां भ्रूण नोड ब्रेक समरूपता6में मोटिवल सिलिया। सिलिया से संबंधित जीन में उत्परिवर्तन हृदय6की असममित संरचना के कारण जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) जैसी बीमारियों से जोड़ा गया है । हाल के अध्ययनों से सीएचडी वाले रोगियों के श्वसन तंत्र में सिलियरी रोग की उच्च घटनाओं के साथ-साथ ऊपरी औरनिचले वायुमार्ग7,8,9,10में पोस्ट-ऑपरेटिव श्वसन जटिलताओं और पुरानी श्वसन तंत्र के लक्षणों की बढ़ी हुई व्यापकता की सूचना मिली है। एचएचडी और सिलियरी डिसफंक्शन वाले रोगियों के साथ या बिना हेट्रोटैक्सी के रोगियों को श्वसन जटिलताओं और नकारात्मक श्वसन परिणामोंके बाद5,8,10के जोखिम में वृद्धि करने का प्रदर्शन किया गया है। संकेत और विकास में उनकी भूमिकाओं से परे, एयरवे सिलिया के महत्व को सिलिओपैथी द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जिनमें से एक प्रमुख उदाहरण प्राथमिक सिलियरी डाइस्किनेशिया (पीसीडी) है। पीसीडी एक जन्मजात विकार है जिसके परिणामस्वरूप मोती श्वसन सिलिया को प्रभावित करने वाले कई उत्परिवर्तन होते हैं, जिससे आवर्ती फेफड़ों के संक्रमण, ब्रोंकिएक्टासिस और संभावित रूप से फेफड़ों के प्रत्यारोपण11की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, भले ही सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) में सिलिया सामान्य हैं, कोकेशियान आबादी में सबसे आम जन्मजात विकार, एमसीसी मोटी, चिपचिपा बलगम के कारण बिगड़ा हुआ है जिसके परिणामस्वरूप सीएफटीआर जीन12में उत्परिवर्तन होता है। पीसीडी और सीएफ के कई माउस मॉडल हैं, साथ ही सीएचडी के मॉडलों की बढ़ती संख्या भी है। अंततः सिलिया कई प्रमुख भूमिकाओं के साथ बहुमुखी संरचनाएं हैं, और वीवो में मोटिवल श्वसन सिलिया के कार्य का आकलन करने की एक विधि पूर्व-नैदानिक अध्ययन के लिए मूल्यवान हो सकती है, और म्यूटेशन के प्रभावों के साथ-साथ म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस (एमसीसी)13पर दवाओं का आकलन कर सकती है। विधि भी इन माउस मॉडल में उपन्यास दवाओं, जीन थेरेपी या एमसीसी पर हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने में मूल्यवान होगा ।
एमसीसी का आकलन करने के लिए कई अलग-अलग मॉडल का इस्तेमाल किया गया है। एक उल्लेखनीय विधि में मेथिलीन ब्लू डाई का उपयोग शामिल है जिसे ब्रोंचस में डाला गया है, जिसमें डाई आंदोलन14के फाइबरऑप्टिक माप द्वारा मापा गया निकासी है। यह विधि डाई के आंदोलन का निरीक्षण करने की क्षमता से सीमित है, जो पूर्व-नैदानिक माउस मॉडल की तुलना में मनुष्यों में अधिक दिनचर्या है। एक अन्य उल्लेखनीय विधि सिंक्रोट्रॉन चरण-कंट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (पीसीएक्सआई) है, जिसका उपयोग वायुमार्ग में व्यक्तिगत कणों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि अपेक्षाकृत नई है और व्यापक रूप सेसुलभनहीं है । वीडियो-माइक्रोस्कोपी के लिए ट्रेकिया को उत्तेजित करके वायुमार्ग का आकलन करने के कई पूर्व वीवो विधियां हैं, हालांकि ये मॉडल मानव रोगियों में थोड़ी उपयोगिता प्रदान करते हैं16। सिलिया इमेजिंग जैसे ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी के लिए उच्च संकल्प तकनीकें उसी तरह सीमित हैं17.
इस लेख में, हम वीवो में एमसीसी को मापने के लिए एक प्रजनन योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग असंख्य पशु मॉडलों में फेफड़ों की मंजूरी को मापने के लिए किया गया है, साथ ही क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज में एमसीसी का अध्ययन करते हैं और इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं के प्रभावों का आकलन करते हैं18,19। यह विधि फेफड़ों में पैदा करने के बाद रेडियोफार्मास्युटिकल 99 मीटरटेक्नेनियम-सल्फर कॉलॉइड(99 मीटरटीसी-एससी), एक अघुलनशील पार्टिकुलेट रेडियोट्रेसर की निकासी को ट्रैक करती है। इसके बाद रेडियोन्यूक्लाइड को सिंगल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT)18,20का उपयोग करके ट्रैक किया जा सकता है । हमने एमसीएसी को मापने के लिए इस तकनीक को दोहरी मोडलाई स्पेक्ट और कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) इमेजिंग का उपयोग करके परिष्कृत किया है, जिसमें रेडियोआइसोटोप के सह-स्थानीयकरण फेफड़ों में गिना जाता है और 6 घंटे से अधिक इन मामलों में कमी को मापने के साथ। दोहरी तौर-तरीके इमेजिंग, सीटी और SPECT छवियों के सह-पंजीकरण के साथ विकिरण के सटीक स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है ब्याज के हमारे क्षेत्र, फेफड़ों के लिए मायने रखता है । यद्यपि हम चूहों में एमसीसी माप के लिए विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं, लेकिन चूहों में एमसीसी का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल को समायोजित किया जा सकता है। कॉलिमेटर को विकिरण खुराक के साथ-साथ समायोजित करने की आवश्यकता होगी। हमारे विचार में, माउस एमसीसी स्कैन छोटे जानवरों के आकार के कारण अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, लेकिन कई मानव विकारों के स्थापित माउस मॉडल की बड़ी संख्या के कारण चूहों की तुलना में अधिक उपयोगी हैं। इसके अतिरिक्त, उनकी कम लागत और पशु कालोनियों में रखरखाव की लागत के कारण, चूहों में एक बड़ा नमूना आकार अधिक व्यवहार्य है।
रोग और विकास दोनों में मोटिवल श्वसन सिलिया की भूमिका विकसित होती रहती है और बेहतर सराहना की जाती है। ट्रेकोब्रोंचियल पेड़ को अस्तर कोशिकाओं की एपिकल सतह पर कई मोटिवल सिलिया की सिंक्रोनस, मेटाकोनल बीटिंग म्यूकोसिलेरी क्लीयरेंस या एमसीसी का उत्पादन करने वाले सेफलाड प्रवाह उत्पन्न करती है। एमसीसी पीसीडी22,सीओपीडी18जैसी अधिग्रहीत बीमारियों जैसी सिलिओपैथी में समझौता किया जाता है, और इसके महत्व को सीएचडी में पहचाना जा रहा है, पारंपरिक रूप से सिलियोपैथी नहीं माना जाता है। हाल के आंकड़ों में दोनों सीएचडी में हेट्रोटैक्सी23 और बिना हेटेरोटैक्सी 7 के साथश्वसनसिलियरी डिसफंक्शन दिखाया गया है । इस तरह के मोटिवल सिलिया डिसफंक्शन को अधिक श्वसन लक्षणों में अनुवाद करने के लिए दिखाया गया था9 के साथ-साथ अधिक पोस्ट-ऑपरेटिव रुग्णता8। अधिकांश, यदि सभी नहीं, इन बीमारियों में से, माउस मॉडल उपलब्ध हैं और चूहों में एमसीसी को मापने के लिए हमारा प्रोटोकॉल एक मूल्यवान उपकरण है जिसका उपयोग संभावित चिकित्सीय परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
पशु मॉडल रोगों और उपचारों के विकास को समझने के लिए उपयोगिता प्रदान करते हैं। वीवो पशु इमेजिंग में जानवरों का बलिदान करने की आवश्यकता के बिना, एक ही जानवरों से कई डेटा अंक प्राप्त करने की क्षमता के साथ आगे उपयोगिता प्रदान करता है, जांचकर्ताओं को रोग के देशांतर पाठ्यक्रम के साथ-साथ उपचार प्रभावों की अध्ययन अवधि का पालन करने की अनुमति देता है। एमसीसी के माउस मॉडल को कई जांचकर्ताओं द्वारा दशकों के दौरान विकसित किया गया है, शुरू में प्लानर सिंटिग्राफी, एक दो आयामी परमाणु इमेजिंग तकनीक24का उपयोग करके बीगल कुत्तों पर प्रदर्शन किया जा रहा है। इस तकनीक को एक दशक बाद चूहों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसके बाद25,26के एक दशक बाद SPECT इमेजिंग के अनुकूलन के बाद। माउस मॉडल में इस तकनीक का विकास पीसीडी जैसे मानव रोगों के कई माउस मॉडल की उपलब्धता के कारण इस तकनीक की प्रासंगिकता में एक प्रमुख विकास था जिसमें सिलियरी फ़ंक्शन में काफी बदलाव आता है। एमसीसी फेफड़ों के denervation और इम्यूनोसप्रेसेशन के माउस मॉडल में मूल्यांकन किया गया है, और अन्य मॉडलों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है19,26। सीएचडी से जुड़े वायुमार्ग रोगों जैसे वायुमार्ग रोगों के साथ मानव रोगों में एमसीसी माप अध्ययन किए गए हैं, और परिणाम मिले हैं कि तकनीक फेफड़ों के शरीर विज्ञान और चिकित्सीय प्रभावकारिता13के दोनों अध्ययनों में सहायता कर सकती है।
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा मात्राकरण के लिए सटीक छवियों को प्राप्त करने के लिए सही इमेजिंग मापदंडों के साथ अधिग्रहण स्थापित कर रहा है। स्पेक्ट अधिग्रहण सेटिंग्स को डिजाइन करते समय कई कारक महत्वपूर्ण होते हैं, जिनमें कॉलेमेटर्स का उपयोग किया जाता है, प्रति क्रांति प्राप्त करने के लिए अनुमानों की संख्या, और रोटेशन चरण आकार। कोलिमेटर चयन अधिग्रहण की संवेदनशीलता और संकल्प में एक प्रमुख कारक है, और अधिग्रहण सेटिंग्स को27उपयोग किए जा रहे कोलिमेटर के अनुरूप होने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, चूहों जैसे बड़े जानवरों का उपयोग करते समय, कॉलिमेटर को समायोजित करने की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए कई पिनहोल कॉलेमेटर अधिक संवेदनशील हैं, लेकिन अनुमानों को ओवरलैपिंग से बचने और अवांछित मल्टीप्लेक्सिंग के कारण एक कदम आकार का चयन करते समय देखभाल की जानी चाहिए, जो कुछ छवि अस्पष्टता की कीमत पर अधिग्रहण की संवेदनशीलता को और बढ़ा सकता है जो पुनर्निर्माण कलाकृतियों25का कारण बन सकता है। पुनर्निर्माण सेटअप भी मात्रात्मक छवियों को उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। MAP3D एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला पुनरावर्तक पुनर्निर्माण एल्गोरिदम है, और पीएसएफ एक आम पुनर्निर्माण मॉडल है। दोनों छवियों के पुनर्निर्माण के लिए विश्वसनीय हैं, लेकिन पुनरावृत्तियों और सबसेट की संख्या स्थापित करते समय देखभाल की जानी चाहिए। पुनरावृत्तियों की एक उच्च संख्या पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक कम्प्यूटेशनल समय में वृद्धि होगी, और आगे वृद्धि पर रिटर्न ह्रासमान के साथ पुनर्निर्माण की गुणवत्ता में वृद्धि होगी ।
इमेजजे में छवियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, उपयोग करने के लिए आदर्श माप उपकरण RawIntDen है, जो चयन में पिक्सेल के योग मूल्य को आउटपुट करता है। जब अलग-अलग आकार के फेफड़ों के आरओआई में SPECT डेटा की मात्रा निर्धारित की जाती है, तो RawIntDen का उपयोग गिनती का एक पूर्ण उपाय प्रदान करता है और आरओआई के क्षेत्र में माप को समायोजित करने से बचता है, जैसे मतलब माप21होगा।
इस तकनीक में त्रुटि के कई संबद्ध स्रोत हैं जिन्हें इस तकनीक को लागू करते समय अन्वेषक को जानकार होना चाहिए। एक उल्लेखनीय कॉन्फिंडर एनेस्थेटिक एजेंटों का उपयोग है। आइसोफलुरेन एक तेजी से अभिनय, सांस एनेस्थेटिक है कि चूहों एक अधिग्रहण के पूरा होने के बाद तेजी से ठीक हो रहा है । हालांकि, चूहों को उनके पिंजरों में ठीक होने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, और आवश्यक से अधिक समय तक एनेस्थेटाइज्ड नहीं रखा जाना चाहिए। हमारे व्यक्तिगत अनुभव (अप्रकाशित डेटा) चूहों में जिन्हें 0 और 6 घंटे के समय-बिंदु के बीच साँस वाले आइसोफ्लून का उपयोग करके लगातार एनेस्थेटाइज्ड रखा गया था, नगण्य निकासी दिखाया गया। इसी तरह, तेजी से वसूली सुनिश्चित करने के लिए एनेस्थेटिक की एक नियंत्रित खुराक भी आवश्यक है। इमेजिंग के लिए फूस के लिए जानवर को सुरक्षित करते समय, सह-पंजीकरण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रेत ट्यूब को फेफड़ों के साथ ओवरलैपिंग से कलाकृतियों से बचने के लिए पेट पर कम रखा जाना चाहिए। इसी तरह, एक गुणवत्ता सीटी छवि सुनिश्चित करने के लिए, एक्स-रे बिखरने से कलाकृतियों से बचने के लिए माउस से किसी भी धातु टैग को हटाने के लिए ध्यान रखना।
वर्तमान एमसीसी प्रोटोकॉल असंख्य पशु मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है । इस तकनीक का स्कैन किए गए जानवरों के स्वास्थ्य पर नगण्य प्रभाव पड़ता है, चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है, और इसकी वजह से इसका उपयोग पहले से ही नाजुक चूहों के स्वास्थ्य को खतरे में डालने के बिना रोग मॉडल के साथ किया जा सकता है। इस पद्धति की ताकत वीवो तकनीक में एक होने से आती है, जो वीडियो-माइक्रोस्कोपी के लिए उत्पादित ट्रेकी के लिए जानवरों के बलिदान के बिना वायुमार्ग फ़ंक्शन के लगातार और दोहराने योग्य माप के अधिग्रहण के लिए अनुमति देती है, कि पूर्व वीवो मॉडल को26की आवश्यकता होती है। एक ही जानवरों के कई स्कैन में दोहराने योग्य माप के उत्पादन में इस तकनीक की निरंतरता, एक ही जानवर के लिए विभिन्न एजेंटों या संभावित चिकित्सा विज्ञान के साथ इलाज करने की अनुमति देता है, और किसी भी पशु मॉडल में निहित जैविक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक ही जानवर के बीच की गई सांख्यिकीय तुलना, जिससे सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाने के लिए आवश्यक नमूना आकार को कम किया जा सके।
एमसीसी तकनीक का उपयोग कर एयरवे समारोह के मूल्यांकन पशु मॉडल की एक किस्म के लिए समायोजित किया जा सकता है और वायुमार्ग स्वास्थ्य के कई अलग अलग मॉडल के लिए लागू है, साथ ही नए उपचारों का परीक्षण। पीसीडी के माउस मॉडल के वायुमार्ग का मूल्यांकन इस तकनीक के साथ-साथ सीओपीडी के मॉडलों का उपयोग करके किया जा सकता है। हमारी विधि का उपयोग एमसीसी पर विभिन्न एनेस्थेटिक्स के अंतर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जो आम नैदानिक उपयोग में हैं। अंत में, वायुमार्ग पर चिकित्सीय एजेंटों के प्रभाव का भी इस मॉडल का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। जैसा कि पहले कहा गया है लेकिन पुनरावृत्ति होती है, क्योंकि यह वीवो माप में एक बीमारी के दौरान एमसीसी आकलन दोहराने की अनुमति देता है, साथ ही समय के साथ चिकित्सीय हस्तक्षेपों के परीक्षण लाभ भी देता है। इसके अतिरिक्त, चूहों सबसे आम प्रयोगशाला जानवरों की नकल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है/मानव रोगों का अध्ययन, के साथ, कुछ मामलों में, मानव रोग के कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से चुनने के लिए उपलब्ध है ।
The authors have nothing to disclose.
M.Z. और K.S.F. और इस काम को पिट इनोवेशन चैलेंज (PInCh) के तहत प्रदान किए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में नैदानिक और ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से, और NHLBI R01 अनुदान HL153407, M.Z. को सम्मानित किया गया ।
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