I denne publikasjonen beskriver vi protokoller for vurdering av luftveismukociliær clearance (MCC) hos mus in vivo ved hjelp av dual-modalitet radionuklidavbildning. Denne protokollen er utformet for en enkelt fotonutslipps computertomografi (SPECT) og computertomografi (CT) oppkjøpsprotokoll ved hjelp av mus hele kroppen (MWB) collimators i et dobbelt SPECT / CT-system.
Respiratorisk motil cilia, spesialiserte organeller av cellen, linje den a apiske overflaten av epitelceller langs luftveiene. Ved å slå på en metachronal, synkron måte, genererer disse flere, motile, actin-baserte organeller en cephaladvæskestrøm som fjerner luftveiene av inhalerte forurensende stoffer og patogener. Med økende miljøforurensning, nye viruspatogener og nye multiresistente bakterier, er flimmerhårgenerert mucociliary clearance (MCC) avgjørende for å opprettholde lungehelsen. MCC er også deprimert i flere medfødte lidelser som primær ciliary dyskinesi, cystisk fibrose samt ervervede lidelser som kronisk obstruktiv lungesykdom. Alle disse lidelsene har etablert, i noen tilfeller flere musemodeller. I denne publikasjonen beskriver vi en metode ved hjelp av en liten mengde radioaktivitet og dual-modalitet SPECT / CT-bildebehandling for å nøyaktig og reprodusere MCC hos mus in vivo. Metoden gjør det mulig å gjenopprette mus etter avbildning, gjøre seriemålinger mulig, og teste potensielle terapeutiske midler langsgående over tid. Dataene i villtypemus viser reproduserbarheten til MCC-målingen så lenge tilstrekkelig oppmerksomhet på detaljer er betalt, og protokollen følges nøye.
Cilia er mikrotubulibaserte cellulære organeller bevart over evolusjonær historie fra alger til mennesker. De kommer fra celleoverflater og har en rekke funksjoner1, alt fra anerkjennelse av lokale miljøsensoriske signaler til motilitet, funksjoner som kan spores tilbake fra mennesker til tidlige encellede eukaryotiskeorganismer 2,3. Cilia kan være ikke-motil og enkelt fungerer som en celle spesialisert antenne for å behandle miljøsignaler; eller motile og flere, slo i synkroniserte, metachronale bølger for å generere væskestrøm, for eksempel i slimhinnen i egglederne og øvre og nedre luftveier, med unntak av terminal bronkioler som fører til alveolene1,2.
Den omfattende epiteloverflaten i luftveiene er utsatt for en konstant kryssild av forurensning i form av en rekke potensielt farlige inhalerte forurensende stoffer og patogener, noe som krever et forsvar. En viktig forsvarsmekanisme er mucociliary apparatet av tracheobronchial treet, hvor en kontinuerlig strøm av utskilles slim er mekanisk transportert ut av luftveiene ved juling av flere motile cilia fôr de apiske overflatene av tracheo-bronkial epitelceller. Disse funksjonen for å fange inhalerte forurensninger, og gjennom deres kontinuerlige, synkron juling, transportere dem cephalad4,5.
Flimmerhår har vist seg å ha sentrale roller som i utviklingen av venstre-høyre mønster i utviklingen av embryoer, hvor motile cilia på embryonal node brytesymmetri 6. Mutasjoner i flimmerhårrelaterte gener har vært knyttet til sykdommer som medfødt hjertesykdom (CHD) på grunn av den asymmetriske strukturen i hjertet6. Nyere studier har rapportert en høy forekomst av ciliary dysfunksjon i luftveiene til pasienter med CHD, samt økt forekomst av postoperative luftveiskomplikasjoner og kroniske luftveissymptomer i øvre og nedreluftveier 7,8,9,10. Pasienter med CHD og ciliary dysfunksjon, med eller uten heterotaxy, har vist seg å ha økt risiko for respiratoriske komplikasjoner og negative respiratoriske utfall etter operativt5,8,10. Utover deres roller i signalisering og utvikling, har betydningen av luftveisflimmeri blitt demonstrert av ciliopathies, hvorav et godt eksempel er primær ciliary dyskinesi (PCD). PCD er en medfødt lidelse som følge av en rekke mutasjoner som påvirker motile respiratoriske flimmerhår, fører til tilbakevendende lungeinfeksjoner, bronkiektasi, og potensielt behovet forlungetransplantasjon 11. I tillegg, selv om flimmerhår er normalt i cystisk fibrose (CF), den vanligste medfødte lidelsen i den kaukasiske befolkningen, er MCC svekket på grunn av tykt, viskøs slim som følge av mutasjoner i CFTR-genet12. Det finnes flere musemodeller av PCD og CF, samt et stadig økende antall modeller av CHD. Til syvende og sist er flimmerhårene allsidige strukturer med mange nøkkelroller, og en metode for å vurdere funksjonen til motile respiratoriske flimmerhårin vivo kan være verdifull for preklinisk studie, og vurdere effekter av mutasjoner samt legemidler på mucociliary clearance (MCC)13. Metoden vil også være verdifull i å vurdere effekter av nye legemidler, genterapi eller intervensjoner på MCC i disse musemodellene.
Det er mange forskjellige modeller som har blitt brukt til å vurdere MCC. En bemerkelsesverdig metode innebærer bruk av metylenblå fargestoff som har blitt innpodet i bronkiene, med klaring målt ved fiberoptisk måling av fargestoffbevegelse14. Denne metoden er begrenset av evnen til å observere bevegelsen av fargestoffet, som er mer rutine hos mennesker enn i prekliniske musemodeller. En annen bemerkelsesverdig metode er synchrotron fase-kontrast røntgenbilde (PCXI), som kan brukes til å spore individuelle partikler i en luftvei. Denne metoden er relativt ny og ikke allment tilgjengelig15. Det finnes mange ex vivo metoder for å vurdere luftveiene ved å eksitere en luftrør for videomikroskopi, men disse modellene gir lite nytte hos menneskelige pasienter16. Teknikker med høy oppløsning for cilia-bildebehandling som optisk sammenhengtomografi er begrenset på samme måtesom 17.
I denne artikkelen presenterer vi en reproduserbar metode for å måle MCC in vivo som har blitt brukt til å måle lungeclearances i utallige dyremodeller, samt studere MCC i kronisk obstruktiv lungesykdom og vurdere effekten av immunsuppressive legemidler18,19. Denne metoden sporer clearance av den radiofarmasøytiske 99mtechnetium-svovelcolloid (99mTc-Sc), en uoppløselig partikkel radiotracer, etter drypping i lungene. Radionuklidet kan deretter spores ved hjelp av enkelt fotonutslipps computertomografi (SPECT)18,20. Vi har ytterligere raffinert denne teknikken for måling av MCC ved hjelp av dual modality SPECT og computertomografi (CT) avbildning med samtidig lokalisering av radioisotop teller til lungene og måle nedgangen i disse tellingene over 6 timer. Dual-modalitetsavbildning, med medregistrering av CT- og SPECT-bilder, gir nøyaktig lokalisering av strålingstellinger til vår interesseregion, lungene. Selv om vi beskriver i detalj metoden for MCC-måling hos mus, kan protokollen justeres for å studere MCC hos rotter. Collimatorene må justeres samt strålingsdose. Etter vår mening er MCC-skanninger av mus mer teknisk utfordrende på grunn av den lille dyrestørrelsen, men mer nyttig enn rotter på grunn av det store antallet etablerte musemodeller av en rekke menneskelige lidelser. I tillegg, på grunn av deres lavere kostnader og vedlikeholdskostnader i dyrekolonier, er en større prøvestørrelse mer mulig hos mus.
Rollen som motil respiratorisk flimmerhår i både sykdom og utvikling fortsetter å utvikle seg og bli bedre verdsatt. Synkron, metachronal juling av flere motile cilia på den apiske overflaten av celler langs tracheobronchial treet generere cephalad flyt produsere mucociliary clearance eller MCC. MCC er kompromittert i ciliopathies som PCD22,ervervede sykdommer som KOLS18, og dens betydning blir anerkjent i CHDs, ikke tradisjonelt anses å være ciliopathies. Nyere data har vist respiratorisk ciliary dysfunksjon i både CHD med heterotaxy23 og uten heterotaxy7. Slike motile cilia dysfunksjon ble vist å oversette til større respiratoriske symptomer9 samt større postoperativ sykelighet8. De fleste, om ikke alle, av disse sykdommene, har musemodeller tilgjengelig, og vår protokoll for måling av MCC hos mus er et verdifullt verktøy som kan brukes til å teste potensielle terapeutiske midler.
Dyremodeller gir verktøy for å forstå sykdommer og utvikling av terapier. In vivo dyreavbildning gir ytterligere nytte med muligheten til å skaffe seg flere datapunkter fra de samme dyrene, uten behov for å ofre dyrene, slik at etterforskerne kan følge langsgående sykdomsforløp samt studievarighet for behandlingseffekter. Musemodellen av MCC har blitt utviklet i løpet av flere tiår av flere etterforskere, først blir utført på beagle hunder ved hjelp av planar scintigraphy, en todimensjonal kjernefysisk bildeteknikk24. Teknikken ble tilpasset for bruk hos mus et tiår senere, etterfulgt av tilpasning til SPECT-avbildning et tiår etterat 25,26. Utviklingen av denne teknikken i musemodeller var en stor utvikling i relevansen av denne teknikken, på grunn av tilgjengeligheten av flere musemodeller av menneskelige sykdommer som PCD der ciliary-funksjonen endres betydelig. MCC har blitt vurdert i musemodeller av lunge denervasjon og immunsuppresjon, og har potensial til å bli brukt sammen med andremodeller 19,26. MCC-målingsstudier hos humane pasienter med luftveissykdommer som CF, astma, PCD og ciliopatier forbundet med CHD er utført, og har gitt resultater at teknikken kan hjelpe både studier av lungefysiologi og terapeutisk effekt13.
En viktig del av denne protokollen er å sette opp oppkjøp med de riktige bildeparametrene for å skaffe nøyaktige bilder for kvantifisering. En rekke faktorer er viktige når du utformer SPECT-oppkjøpsinnstillinger, inkludert hvilke collimators som brukes, antall projeksjoner for å skaffe per omdreining og rotasjonstrinnstørrelse. Collimator-valg er en viktig faktor i følsomheten og oppløsningen av oppkjøpet, og oppkjøpsinnstillingene må kanskje skreddersys til at collimatoren brukes27. Alternativt, når du bruker større dyr som rotter, må collimatorene justeres. Flere pinhole collimators for eksempel er mer følsomme, men forsiktighet bør tas når du velger en trinnstørrelse for å unngå overlappende projeksjoner og forårsaker uønsket multipleksing, noe som kan ytterligere øke følsomheten for oppkjøpet på bekostning av noen bilde tvetydighet som kan forårsake rekonstruksjon artefakter25. Rekonstruksjon oppsett er også nøkkelen til å generere kvantifiserbare bilder. MAP3D er en vanlig iterativ rekonstruksjonsalgoritme, og PSF er en vanlig rekonstruksjonsmodell. Begge er pålitelige for å rekonstruere bilder, men forsiktighet bør tas når du angir antall iterasjoner og undergrupper. Et høyere antall iterasjoner vil øke beregningstiden som kreves for gjenoppbyggingen, og øke kvaliteten på gjenoppbyggingen med avtagende avkastning ved ytterligere økning.
For å kvantifisere bilder i ImageJ, er det ideelle måleverktøyet som skal brukes RawIntDen, som utdata summeringsverdien av piksler i et utvalg. Når du kvantifiserer SPECT-data på tvers av lunge-ROIer i ulik størrelse, gir bruken av RawIntDen et absolutt mål på antall og unngår å justere målingen til området av avkastningen, som den gjennomsnittlige målingenville 21.
Denne teknikken har en rekke tilknyttede feilkilder som etterforskeren bør være oppmerksom på når du bruker denne teknikken. En bemerkelsesverdig confounder er bruken av bedøvelsesmidler. Isofluran er en hurtigvirkende, inhalert bedøvelse som musene gjenoppretter fra raskt etter ferdigstillelse av et oppkjøp. Det bør imidlertid tas hensyn til å gi musene god tid til å komme seg i burene sine, og ikke holdes bedøvet lenger enn nødvendig. I vår personlige erfaring (upubliserte data) mus som ble holdt bedøvet kontinuerlig ved hjelp av inhalert isofluran mellom 0 og 6 timers tidspunkt viste ubetydelig clearance. På samme måte er en kontrollert dose bedøvelse også nødvendig for å sikre rask gjenoppretting. Ved sikring av dyret til pallen for avbildning, bør fantomrøret som brukes til samregistrering holdes lavt på magen for å unngå gjenstander fra overlapping med lungene. Likeledes, for å sikre en kvalitet CT bilde, ta vare på å fjerne metall koder fra musen for å unngå gjenstander fra røntgen spredning.
Den nåværende MCC-protokollen kan brukes på utallige dyremodeller. Denne teknikken har en ubetydelig effekt på helsen til dyret skannet, tolereres godt av mus, og på grunn av dette kan den brukes med sykdomsmodeller uten å risikere helsen til allerede delikate mus. Styrken av denne metodikken kommer fra at det er en in vivo teknikk, noe som gjør det mulig å anskaffe konsekvente og repeterbare målinger av luftveisfunksjonen uten offer av dyr for å avgiftsde tracheas for videomikroskopi, at ex vivo-modeller krever26. Konsistensen av denne teknikken i å produsere repeterbare målinger på tvers av flere skanninger av de samme dyrene, gjør det mulig for det samme dyret å bli behandlet med forskjellige midler eller potensielle terapeutiske midler, og statistiske sammenligninger gjort mellom samme dyr for å redusere biologisk variasjon iboende i enhver dyremodell, og dermed redusere prøvestørrelsen som trengs for å vise statistisk signifikante forskjeller.
Vurderingen av luftveisfunksjonen ved hjelp av MCC-teknikken kan justeres til en rekke dyremodeller og brukes på mange forskjellige modeller av luftveishelse, samt testing av nye terapier. Luftveiene av musemodeller av PCD kan vurderes ved hjelp av denne teknikken, samt modeller av KOLS. Vår metode kan også benyttes til å studere differensialeffekter av ulike anestetika på MCC som er i vanlig klinisk bruk. Til slutt kan effekten av terapeutiske midler på luftveiene også vurderes ved hjelp av denne modellen. Som tidligere nevnt, men bærer repetisjon, da det er en in vivo måling det tillater gjentatte MCC vurderinger i løpet av en sykdom, samt teste fordelene med terapeutiske inngrep over tid. I tillegg er mus de vanligste laboratoriedyrene som brukes til å etterligne / studere menneskelige sykdommer, med i noen tilfeller flere transgene musemodeller av menneskelig sykdom tilgjengelig å velge mellom.
The authors have nothing to disclose.
M.Z. og K.S.F. og dette arbeidet ble støttet av et stipend tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh), gjennom Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh, og NHLBI R01 stipend HL153407, tildelt M.Z.
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |