I denna publikation beskriver vi protokoll för bedömning av luftvägarna mucociliary clearance (MCC) hos möss in vivo med hjälp av dual-modality radionuklid imaging. Detta protokoll är utformat för en enda foton utsläpp datortomografi (SPECT) och datortomografi (CT) förvärv protokoll med mus hela kroppen (MWB) collimatatorer i ett dubbelt SPECT /CT system.
Andningsmotilcilia, specialiserade organeller i cellen, fodrar den apatiska ytan av epitelceller som fodrar luftvägarna. Genom att slå på ett metakronalt, synkronalt sätt genererar dessa flera, motila, aktinbaserade organeller ett cephalad flytande flöde rensa luftvägarna av inhalerade föroreningar och patogener. Med ökande miljöföroreningar, nya viruspatogener och framväxande multiresistenta bakterier är ciliagenererad mucoiliary clearance (MCC) avgörande för att upprätthålla lunghälsan. MCC är också deprimerad i flera medfödda sjukdomar som primära ciliary dyskinesi, cystisk fibros samt förvärvade sjukdomar som kronisk obstruktiv lungsjukdom. Alla dessa störningar har etablerat, i vissa fall flera, musmodeller. I den här publikationen beskriver vi en metod med en liten mängd radioaktivitet och SPECT/CT-avbildning med dubbla modaliteter för att exakt och reproducerbart mäta MCC hos möss in vivo. Metoden möjliggör återhämtning av möss efter avbildning, vilket möjliggör seriella mätningar och testar potentiella terapier längs tid. Data i vilda möss visar reproducerbarheten av MCC-mätningen så länge adekvat uppmärksamhet på detaljer ägnas, och protokollet följs strikt.
Cilia är mikrotubulebaserade cellulära organeller bevarade över evolutionär historia från alger till människor. De kommer från cellytor och har ett antal funktioner1, allt från erkännande av lokala miljösensoriska signaler till motilitet, funktioner som kan spåras tillbaka från människor till tidiga encelliga eukaryota organismer2,3. Cilia kan vara icke-motil och singel som fungerar som en cells specialiserade antenn för att bearbeta miljösignaler; eller motile och flera, slår i synkroniserade, metachronal vågor för att generera vätskeflöde, såsom i fodret i äggledarna och de övre och nedre luftvägarna, med undantag för de terminala bronkiolerna som leder till alveolerna1,2.
Den omfattande epitelial ytan av luftvägarna utsätts för en konstant spärreld av förorening i form av en mängd potentiellt farliga inhalerade föroreningar och patogener, vilket kräver ett försvar. En viktig försvarsmekanism är den mucociliary apparaten i tracheobronchial trädet, där ett kontinuerligt flöde av utsöndrat slem transporteras mekaniskt ut ur luftvägarna genom misshandel av flera motila cilia foder de apatiska ytorna i tracheo-bronkial epitelceller. Dessa funktion för att fånga in inhalerade föroreningar, och genom deras kontinuerliga, synkrona misshandel, transportera dem cephalad4,5.
Cilia har visat sig ha nyckelroller som i utvecklingen av vänster-höger mönstring i utvecklingen av embryon, där motile cilia vid den embryonala noden brytasymmetri 6. Mutationer i ciliarelaterade gener har kopplats till sjukdomar som medfödd hjärtsjukdom (CHD) på grund av hjärtats asymmetriska struktur6. Nyligen genomförda studier har rapporterat en hög incidens av ciliary dysfunktion i luftvägarna hos patienter med CHD, liksom en ökad prevalens av postoperativa luftvägarna komplikationer och kroniska luftvägarna symtom i övre och nedreluftvägarna 7,8,9,10. Patienter med CHD och ciliary dysfunktion, med eller utan heterotaxy, har visat sig ha ökad risk för luftvägarna komplikationer och negativa luftvägarna resultat postoperativt5,8,10. Utöver deras roller i signalering och utveckling, vikten av luftvägarna cilia har visats av ciliopathies, varav ett främsta exempel är primära ciliary dyskinesi (PCD). PCD är en medfödd sjukdom som härrör från ett antal mutationer som påverkar den motila luftvägarna cilia, vilket leder till återkommande lunginfektioner, bronkiectasis, och potentiellt behovet av lungtransplantation11. Dessutom, även om cilia är normala i cystisk fibros (CF), vanligaste medfödda störning i den kaukasiska befolkningen, är MCC nedsatt på grund av tjocka, trögflytande slem som härrör från mutationer i CFTRgenen 12. Det finns flera musmodeller av PCD och CF, liksom ett ständigt ökande antal modeller av CHD. I slutändan är cilia mångsidiga strukturer med många nyckelroller, och en metod för att bedöma funktionen av motile respiratory cilia in vivo kan vara värdefullt för preklinisk studie, och bedöma effekter av mutationer samt läkemedel på mucociliary clearance (MCC)13. Metoden skulle också vara värdefull för att bedöma effekterna av nya läkemedel, genterapi eller interventioner på MCC i dessa musmodeller.
Det finns många olika modeller som har använts för att bedöma MCC. En anmärkningsvärd metod innebär användning av metylenblå färgämne som har ingjutits i bronkerna, med clearance mätt genom fiberoptisk mätning av färgrörelse14. Denna metod begränsas av förmågan att observera färgämnets rörelse, vilket är mer rutinmässigt hos människor än i prekliniska musmodeller. En annan anmärkningsvärd metod är synkrotronfaskontraströntgenavbildning (PCXI), som kan användas för att spåra enskilda partiklar i en luftväg. Denna metod är relativt ny och inte allmänt tillgänglig15. Det finns många ex vivo metoder för att bedöma luftvägarna genom att excising en luftstrupe för videomikroskopi, men dessa modeller ger lite nytta hos mänskliga patienter16. Högupplösta tekniker för cilia imaging såsom optisk koherenstomografi är begränsade på samma sätt17.
I den här artikeln presenterar vi en reproducerbar metod för att mäta MCC in vivo som har använts för att mäta lung clearances i otaliga djurmodeller, samt studera MCC i kronisk obstruktiv lungsjukdom och bedöma effekterna av immunsuppressivaläkemedel 18,19. Denna metod spårar clearance av radiopharmaceutical 99mtechnetium-svavel kolloid (99mTc-Sc), en olöslig partikelradikal radiotracer, efter instillation i lungorna. Radionukliden kan sedan spåras med hjälp av en fotonemissionstomografi (SPECT)18,20. Vi har ytterligare förfinat denna teknik för att mäta MCC genom att använda dual modality SPECT och datortomografi (CT) imaging med samlokalisering av radioisotope räknas till lungorna och mäta minskningen av dessa räkningar över 6 timmar. Dubbelmodalitetsavbildning, med samregistrering av CT- och SPECT-bilder möjliggör korrekt lokalisering av strålningsräkningar till vår region av intresse, lungorna. Även om vi i detalj beskriver metoden för MCC-mätning hos möss, kan protokollet justeras för att studera MCC hos råttor. Collimatorerna skulle behöva justeras samt stråldosen. Enligt vår mening är mus MCC-skanningar mer tekniskt utmanande på grund av den lilla djurstorleken, men mer användbara än råttor på grund av det stora antalet etablerade musmodeller av ett antal mänskliga störningar. Dessutom, på grund av deras lägre kostnad och kostnad för underhåll i djurkolonier, är en större provstorlek mer genomförbar hos möss.
Motile respiratory cilias roll i både sjukdom och utveckling fortsätter att utvecklas och uppskattas bättre. Synkron, metakron misshandel av flera motila cilia på den akrona ytan av celler som fodrar trakeobronchial trädet generera cephalad flöde producerar mucociliary clearance eller MCC. MCC äventyras i ciliopathies som PCD22,förvärvade sjukdomar som KOL18, och dess betydelse erkänns i CHDs, inte traditionellt anses vara ciliopathies. Nya data har visat respiratorisk ciliary dysfunktion i både CHD med heterotaxy23 och utan heterotaxy7. Sådan motile cilia dysfunktion visade sig översättas till störreluftvägarna symtom 9 samt större postoperativa sjuklighet8. De flesta, om inte alla, av dessa sjukdomar har musmodeller tillgängliga och vårt protokoll för att mäta MCC hos möss är ett värdefullt verktyg som kan användas för att testa potentiella terapier.
Djurmodeller ger nytta för att förstå sjukdomar och utveckla terapier. In vivo djuravbildning ger ytterligare nytta med förmågan att förvärva flera datapunkter från samma djur, utan att behöva offra djuren, så att utredarna kan följa längsgående sjukdomsförloppet samt studiens varaktighet av behandlingseffekter. Musmodellen av MCC har utvecklats under årtionden av flera utredare, ursprungligen utförs på beagle hundar med hjälp av planar scintigrafi, en tvådimensionell nukleär bildteknik24. Tekniken anpassades för användning på möss ett decennium senare, följt av anpassning till SPECT-avbildning ett decennium efterdet 25,26. Utvecklingen av denna teknik i musmodeller var en viktig utveckling i relevansen av denna teknik, på grund av tillgången till flera musmodeller av mänskliga sjukdomar som PCD där ciliary funktion ändras avsevärt. MCC har bedömts i musmodeller av lungförnekelse och immunsuppression, och har potential att användas tillsammans med andra modeller19,26. MCC-mätstudier på mänskliga patienter med luftvägssjukdomar som CF, astma, PCD och ciliopathies associerade med CHD har utförts, och har gett resultat att tekniken kan hjälpa både studier av lungfysiologi och terapeutisk effekt13.
En viktig del av detta protokoll är att ställa in förvärv med rätt bildparametrar för att få korrekta bilder för kvantifiering. Ett antal faktorer är viktiga när du utformar SPECT-anskaffningsinställningar, inklusive vilka kollimatorer som används, antalet projektioner att förvärva per varv och rotationsstegstorlek. Collimatorval är en viktig faktor för förvärvets känslighet och upplösning, och förvärvsinställningarna kan behöva skräddarsys för den kollimatör som används27. Alternativt, när man använder större djur som råttor, skulle collimatörerna behöva justeras. Flera pinhole collimators till exempel är känsligare, men försiktighet bör vidtas när du väljer en stegstorlek för att undvika överlappande projektioner och orsaka oönskad multiplexering, vilket ytterligare kan öka känsligheten för förvärvet på bekostnad av vissa bild tvetydigheter som kan orsaka rekonstruktion artefakter25. Rekonstruktionsinställning är också nyckeln till att generera kvantifierbara bilder. MAP3D är en vanlig iterativ rekonstruktionsalgoritm, och PSF är en vanlig rekonstruktionsmodell. Båda är tillförlitliga för att rekonstruera bilder, men försiktighet bör vidtas när du ställer in antalet iterationer och delmängder. Ett högre antal iterationer kommer att öka den beräkningstid som krävs för återuppbyggnaden och öka kvaliteten på återuppbyggnaden med minskande avkastning vid ytterligare ökning.
För att kvantifiera bilder i ImageJ är det perfekta mätverktyget som ska användas RawIntDen, som matar ut det summavärdet för pixlar i en markering. Vid kvantifiering av SPECT-data över olika storleksanpassade lung-ROI ger användningen av RawIntDen ett absolut mått på antal och undviker att justera mätningen till ROI-området, som den genomsnittligamätningen skulle 21.
Denna teknik har ett antal associerade felkällor som prövaren bör vara medveten om när man tillämpar denna teknik. En anmärkningsvärd confounder är användningen av bedövningsmedel. Isofluran är ett snabbverkande, inhalerat bedövningsmedel som mössen återhämtar sig från snabbt efter slutförandet av ett förvärv. Man bör dock vara noga med att ge mössen gott om tid att återhämta sig i sina burar och inte hållas sövd längre än nödvändigt. Enligt vår personliga erfarenhet (opublicerade data) möss som hölls bedövade kontinuerligt med inhalerad isofluran mellan 0 och 6 timmars tidspunkt visade försumbar clearance. På samma sätt är en kontrollerad dos bedövningsmedel också nödvändig för att säkerställa snabb återhämtning. Vid fasthållning av djuret på pallen för avbildning bör fantomröret som används för samregistrering hållas lågt på magen för att undvika att artefakter överlappar lungorna. På samma sätt, för att säkerställa en CT-bild av hög kvalitet, var noga med att ta bort alla metalltaggar från musen för att undvika artefakter från röntgenspridning.
Det nuvarande MCC-protokollet kan tillämpas på otaliga djurmodeller. Denna teknik har en försumbar effekt på djurets hälsa skannad, tolereras väl av möss, och på grund av detta kan den användas med sjukdomsmodeller utan att riskera hälsan hos redan känsliga möss. Styrkan i denna metod kommer från att det är en in vivo-teknik, vilket gör det möjligt att förvärva konsekventa och repeterbara mätningar av luftvägsfunktionen utan att djuren offras för att punktskatta luftstrupar för videomikroskopi, som ex vivo-modellerkräver 26. Konsekvensen i denna teknik vid framställning av repeterbara mätningar över flera skanningar av samma djur gör det möjligt att behandla samma djur med olika agenser eller potentiella terapier, och statistiska jämförelser görs mellan samma djur för att minska den biologiska variabiliteten hos någon djurmodell, vilket minskar den provstorlek som behövs för att uppvisa statistiskt signifikanta skillnader.
Bedömningen av luftvägsfunktionen med MCC-tekniken kan anpassas till en mängd olika djurmodeller och tillämpas på många olika modeller av luftvägshälsa, samt testa nya terapier. Luftvägarna hos musmodeller av PCD kan bedömas med hjälp av denna teknik, liksom modeller av KOL. Vår metod kan också användas för att studera differentiella effekter av olika bedövningsmedel på MCC som är i vanlig klinisk användning. Slutligen kan effekterna av terapeutiska medel på luftvägarna också bedömas med hjälp av denna modell. Som tidigare nämnts men bär upprepning, eftersom det är en in vivo-mätning möjliggör det upprepade MCC-bedömningar under en sjukdom, liksom testfördelar med terapeutiska interventioner över tid. Dessutom är möss de vanligaste laboratoriedjuren som används för att efterlikna / studera mänskliga sjukdomar, med i vissa fall flera transgena musmodeller av mänsklig sjukdom tillgängliga att välja mellan.
The authors have nothing to disclose.
M.Z. och K.S.F. och detta arbete stöddes av ett bidrag som tilldelades inom ramen för Pitt Innovation Challenge (PInCh), genom Clinical and Translational Science Institute vid University of Pittsburgh, och NHLBI R01-stipendiet HL153407, tilldelat M.Z.
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |